Neue Erkenntnisse zur Spermienrheotaxis, -agglutination und -bündelbildung bei Sharkasi-Hühnern basierend auf einer In-vitro-Studie

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 13003 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Fruchtbarkeit von Vögeln hängt von ihrer Fähigkeit ab, ausreichende Populationen lebensfähiger Spermien über einen längeren Zeitraum in Spermienspeicherröhrchen (SSTs) zu speichern. Die genauen Mechanismen, durch die Spermien in die SSTs eindringen, sich dort aufhalten und aus ihnen austreten, sind immer noch umstritten. Sharkasi-Hühnersperma zeigte eine hohe Tendenz zur Agglutination und bildete bewegliche, fadenförmige Bündel aus vielen Zellen. Da es schwierig ist, die Beweglichkeit und das Verhalten der Spermien innerhalb des undurchsichtigen Eileiters zu beobachten, verwendeten wir ein Mikrofluidikgerät mit einem Mikrokanalquerschnitt, der dem von Spermiendrüsen sehr ähnlich ist und die Untersuchung der Agglutination und des Beweglichkeitsverhaltens der Spermien ermöglicht. In dieser Studie wird erörtert, wie Spermienbündel gebildet werden, wie sie sich bewegen und welche Rolle sie bei der Verlängerung der Verweildauer der Spermien in den SSTs spielen könnten. Wir untersuchten die Spermiengeschwindigkeit und das Rheotaxisverhalten, wenn durch hydrostatischen Druck (Strömungsgeschwindigkeit = 33 µm/s) ein Flüssigkeitsstrom in einem Mikrofluidikkanal erzeugt wurde. Spermien neigten dazu, gegen den Strom zu schwimmen (positive Rheotaxis) und Spermienbündel hatten eine deutlich geringere Geschwindigkeit im Vergleich zu einzelnen Spermien. Es wurde beobachtet, dass Spermienbündel in einer spiralförmigen Bewegung schwimmen und an Länge und Dicke zunehmen, wenn mehr einzelne Spermien rekrutiert werden. Es wurde beobachtet, dass sich Spermienbündel den Seitenwänden der Mikrofluidikkanäle näherten und daran festhielten, um zu verhindern, dass sie mit einer Flüssigkeitsströmungsgeschwindigkeit von > 33 µm/s mitgerissen werden. Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie ergab, dass die Spermienbündel von einer reichlich dichten Substanz getragen wurden. Die Ergebnisse zeigen die ausgeprägte Beweglichkeit der Spermien von Sharkasi-Hühnern sowie die Fähigkeit der Spermien, zu agglutinieren und bewegliche Bündel zu bilden, was ein besseres Verständnis der langfristigen Spermienspeicherung in den SSTs ermöglicht.

Um bei Menschen und den meisten Tieren eine Befruchtung zu erreichen, müssen Spermien und Eizellen zum richtigen Zeitpunkt den Befruchtungsort erreichen. Daher muss die Kopulation vor oder während des Eisprungs stattfinden. Einige Säugetierarten wie Hunde und Nichtsäugetierklassen wie Insekten, Fische, Reptilien und Vögel hingegen speichern Spermien über lange Zeiträume in ihren Fortpflanzungsorganen, bis ihre Eier zur Befruchtung bereit sind (asynchrone Befruchtung1). ). Vögel sind in der Lage, über einen Zeitraum von 2 bis 10 Wochen lebensfähige Spermien zu behalten, die die Eizellen befruchten können2.

Dies ist ein einzigartiges Merkmal, das Vögel von anderen Tieren unterscheidet, da es eine hohe Befruchtungswahrscheinlichkeit nach einer einzigen Befruchtung über mehrere Wochen hinweg ermöglicht, ohne dass Paarung und Eisprung synchronisiert werden müssen. Das wichtigste Spermienspeicherorgan, die sogenannten Spermienspeichertubuli (SSTs), befindet sich in den inneren Schleimhautfalten des uterovaginalen Übergangs3. Bis heute sind die Mechanismen des Spermieneintritts, des Aufenthalts und der Evakuierung aus den Spermienreservoirs nicht vollständig geklärt. Nach früheren Untersuchungen gab es hierzu mehrere Hypothesen, von denen sich jedoch keine bestätigt hat.

Forman4 schlug vor, dass Spermien ihren Aufenthalt im Lumen von SSTs durch kontinuierliche oszillierende Bewegung entgegen der Richtung einer Flüssigkeit aufrechterhalten, die durch Proteinkanäle auf den Epithelzellen von SSTs fließt (Rheotaxis). Aufgrund der kontinuierlichen Flagellenaktivität, die erforderlich ist, um die Spermien im SST-Lumen zu halten, wird ATP erschöpft und die Beweglichkeit nimmt schließlich ab, bis die Spermien durch den Flüssigkeitsfluss aus den Spermienreservoirs befördert werden, um eine neue Reise zu beginnen, indem sie den Eileiter aufsteigen, um sie zu befruchten Eizelle (Forman4). Dieses Modell der Spermienlagerung wird durch die Ergebnisse gestützt, die das Vorhandensein der Aquaporine 2, 3 und 9 im SST-Epithel durch Immunzytochemie bestätigen5. Bisher fehlen Studien zur Spermienrheotaxis bei Hühnern und der Rolle, die sie bei der Speicherung von SSTs, der vaginalen Spermienauswahl und der Spermienkonkurrenz spielen könnte. Bei Hühnern wird das Spermienejakulat nach der natürlichen Paarung in der Vagina abgelagert; jedoch werden mehr als 80 % der Spermien kurz nach der Kopulation aus der Vagina ausgeschieden6. Dies deutet darauf hin, dass die Vagina bei Vogelarten der primäre Spermienselektionsort ist. Darüber hinaus wurde auch berichtet, dass weniger als 1 % der in der Vagina befruchteten Spermien in die SSTs gelangen2. Wenn Hühner künstlich in die Vagina besamt wurden, nahm die Anzahl der Spermien, die die SSTs erreichten, 24 Stunden nach der Befruchtung tendenziell zu. Bisher war der Mechanismus der Spermienselektion in diesem Prozess unbekannt und die Beweglichkeit der Spermien könnte eine wichtige Rolle bei der Spermienaufnahme in SSTs spielen4. Aufgrund der dicken und undurchsichtigen Wand des Eileiters ist es bei Vogelarten schwierig, die Spermienmotilität im Eileiter direkt zu überwachen. Daher fehlen uns grundlegende Kenntnisse darüber, wie Spermien nach der Insemination in SSTs übertragen werden.

Rheotaxis wurde kürzlich als wichtiger Faktor angesehen, der den Spermientransport in den Genitalien von Säugetieren steuert7. Basierend auf der Fähigkeit lebensfähiger Spermien, gegen eine Strömung zu wandern, verwendeten Zaferani et al.8 ein mikrofluidisches Hürdensystem, um bewegliche Spermien passiv aus der Samenprobe in einer Hürde zu isolieren. Diese Spermiensortierung ist für medizinische Unfruchtbarkeitsbehandlungen und klinische Studien erforderlich und wird im Vergleich zu herkömmlichen Methoden bevorzugt, die zeit- und arbeitsaufwändig sind und sich nachteilig auf die Morphologie und Strukturintegrität der Spermien auswirken könnten8. Bisher gab es jedoch keine Studie über die Auswirkung der Strömung in den Genitalien von Hühnern auf die Spermienmotilität.

Unabhängig vom Mechanismus, der die Spermienspeicherung in SSTs aufrechterhält, haben eine Reihe von Forschern beobachtet, dass in den SSTs von Hühnern9,10, Wachteln2 und Truthähnen11 ansässige Spermien „Kopf an Kopf“ agglutinieren und Bündel agglutinierter Spermien bilden. Die Autoren vermuten, dass ein Zusammenhang zwischen dieser Agglutination und der längeren Aufbewahrungsdauer der Spermien in den SSTs besteht.

Tingari und Lake12 berichteten über den engen Zusammenhang zwischen Spermien in den Spermien-Wirtsdrüsen von Hühnern und waren neugierig, ob Vogelspermien auf die gleiche Weise agglutinieren wie Säugetierspermien. Sie vermuteten, dass die tiefe Verbindung zwischen den Samenzellen in den Samendrüsen auf den Druck zurückzuführen sein könnte, der durch die Existenz einer großen Anzahl von Samenzellen auf kleinem Raum entsteht.

Vorübergehende Anzeichen einer Agglutination waren sichtbar, wenn das Spermatozoenverhalten in frischen hängenden Tropfenobjektträgern beurteilt wurde, insbesondere entlang der Kante des Samentröpfchens. Allerdings wurde die Agglutination häufig durch die Wirbelbewegung unterbrochen, die mit der kontinuierlichen Motilität einhergeht, was die flüchtige Natur dieses Phänomens erklärt9. Die Forscher stellten auch längliche „fadenartige“ Zellansammlungen fest, wenn dem Sperma Verdünnungsmittel zugesetzt wurde.

Ein früher Versuch, Spermiendrüsen zu simulieren, wurde durchgeführt, indem ein empfindlicher Draht von einem hängenden Tropfenobjektträger entfernt wurde, wodurch ein längliches Vesikel aus dem Samentröpfchen herausragte, ähnlich einer Spermiendrüse9. Die Spermien richteten sich sofort in einem parallelen Muster innerhalb des Vesikels auf, aber die Gesamteinheit verblasste aufgrund dreidimensionaler Einschränkungen schnell. Um Spermienagglutinationen zu untersuchen, ist es daher notwendig, die Bewegung und das Verhalten der Spermien direkt in isolierten Spermienspeicherkanälchen zu beobachten, was jedoch schwierig zu erreichen ist. Daher ist die Entwicklung eines Werkzeugs zur Simulation der Spermiendrüse erforderlich, um Studien zur Spermienmotilität und zum Agglutinationsverhalten zu unterstützen. Brillard et al.13 berichteten, dass die durchschnittliche Länge der Spermienspeicherkanälchen bei ausgewachsenen Hühnern 400–600 µm beträgt, einige SSTs können jedoch 2000 µm messen. Mero und Ogasawara14 klassifizierten Spermiendrüsen in vergrößerte und nicht vergrößerte Spermienspeicherröhrchen, die beide ähnliche Längen (etwa 500 µm) und Halsbreiten (ungefähr 38 µm) hatten, aber die Röhrchen der beiden Gruppen hatten durchschnittliche Lumendurchmesser von 56,6 und 11,2 µm bzw. In der aktuellen Studie haben wir ein mikrofluidisches Gerät mit Kanalabmessungen von 200 µm × 20 µm (B × H) verwendet, um einen Querschnitt zu erhalten, der dem von vergrößerten SSTs etwas nahekommt. Darüber hinaus untersuchten wir die Spermienmotilität und das Agglutinationsverhalten in einer fließenden Flüssigkeit, um mit Formans Hypothese in Einklang zu stehen, dass die Epithelzellen von SSTs Flüssigkeit produzieren, die die Spermien durch Schwimmen entgegen der Strömungsrichtung (Rheotaxis) im Lumen hält.

Ziel der Studie war es, die Probleme bei der Beobachtung der Spermienmotilität im Eileiter zu überwinden und die Schwierigkeiten bei der Untersuchung der Spermienrheotaxis und des Spermienverhaltens in einer dynamischen Umgebung zu vermeiden. Es wurde ein mikrofluidisches Gerät verwendet, das hydrostatischen Druck erzeugte, um die Spermienmotilität in den Genitalien von Hühnern zu modellieren.

Wenn ein Tropfen einer verdünnten Samenprobe (1:40) in das Mikrokanalgerät geladen wurde, wurden zwei Arten der Spermienmotilität (einzelne und gebündelte) erkannt. Darüber hinaus zeigten die Spermien die Tendenz, gegen den Strom zu schwimmen (positive Rheotaxis; Videos 1, 2). Obwohl Spermienbündel eine geringere Geschwindigkeit aufwiesen als einzelne Spermien (p < 0,001), erhöhten sie den Prozentsatz an Spermien mit positiver Rheotaxis (p < 0,001; Tabelle 2). Der Prozentsatz positiver Rheotaxis wurde auf etwa 53 % bzw. 85 % für einzelne Spermien und Bündel geschätzt.

Es wurde beobachtet, dass die Spermatozoen von Sharkasi-Hühnern unmittelbar nach der Ejakulation fadenförmige Bündel bilden, die aus vielen Dutzend Individuen bestehen. Diese Bündel nehmen mit der Zeit an Länge und Dicke zu und können stundenlang in vitro verbleiben, bevor sie sich verteilen (Video 3). Diese fadenförmigen Bündel ähneln in ihrer Form denen von Echidna-Spermien, die im Endsegment des Nebenhodens gebildet werden. Es wurde festgestellt, dass Sharkasi-Hühnersperma eine hohe Tendenz zur Agglutination aufweist und bereits weniger als eine Minute nach der Entnahme ein Netz aus Bündeln bildet. Diese Bündel sind beweglich und können an jeder angrenzenden Wand oder an jedem statischen Objekt haften. Obwohl Spermienbündel die Geschwindigkeit der Spermien verringern, war es offensichtlich, dass sie makroskopisch ihre Linearität erhöhen. Die Länge der Bündel variiert je nach Anzahl der im Bündel versammelten Spermien. Man erkennt zwei Segmente des Bündels: den Anfangsteil, der die freien Köpfe der agglutinierten Spermien umfasst, und den Endteil, der die Schwänze und die gesamten distalen Spermien umfasst. Mit einer Hochgeschwindigkeitskamera (950 Bilder/s) beobachteten wir, dass die freien Köpfe der agglutinierten Spermien im Anfangsteil des Bündels aufgrund ihrer oszillierenden Bewegungen, die den Rest des Bündels mitziehen, für die Bündelbeweglichkeit verantwortlich sind bündeln sich in einer spiralförmigen Bewegung (Video 4). Bei langen Bündeln wurde jedoch beobachtet, dass einige freie Köpfe anhaftender Spermien im Körper und im Endteil des Bündels wie Paddel wirkten und die Bewegung des Bündels unterstützten.

Die Spermienbündel bewegten sich parallel zueinander, wenn sie sich in einem langsamen Flüssigkeitsstrom befanden; Sie beginnen sich jedoch zu überlappen und haften an jedem stationären Objekt, damit sie nicht von der fließenden Strömung mitgerissen werden, wenn die Strömungsgeschwindigkeit erhöht wird. Die Bildung des Bündels beginnt damit, dass sich wenige Spermien einander annähern, diese beginnen sich synchron zu bewegen, sich umeinander zu wickeln und dann an der Klebesubstanz festzukleben. Die Abbildungen 1 und 2 zeigen Spermien, die sich einander nähern und einen Verbindungspunkt bilden, weil sich die Schwänze umeinander wickeln.

Die Forscher übten hydrostatischen Druck aus, um einen Flüssigkeitsfluss im Mikrokanal zu erzeugen, in dem die Spermienrheotaxis untersucht wurde. Es wurden Mikrokanäle mit Abmessungen von 200 μm × 20 μm (B × H) und einer Länge von 3,6 μm verwendet. Der Mikrokanal zwischen den Reservoirs mit an den Enden montierten Spritzen wurde verwendet. Um den Kanal besser sichtbar zu machen, wurden Lebensmittelfarben verwendet.

Bündelverbindungen und Befestigungen an den Wänden. Video aufgenommen vom Phasenkontrastmikroskop. Bilder aus der Phasenkontrastmikroskopie und Zeichnungen begleiten jedes Bild zur Präsentation. (A) Die Verbindung zwischen zwei Fäden durch Spiralbewegung, um dem Fluss zu widerstehen (roter Pfeil). (B) Befestigung zwischen den Bündeln und der Kanalwand (roter Pfeil); gleichzeitig sind sie mit zwei weiteren Bündeln verbunden (gelber Pfeil). (C) Spermienbündel im Mikrofluidikkanal beginnen miteinander verbunden zu werden (rote Pfeile), wodurch ein Netz aus Spermienbündeln entsteht. (D) Die Bildung eines Netzwerks von Spermienbündeln.

Als ein Tropfen verdünnten Spermas auf das Mikrofluidikgerät geladen wurde und ein Fluss erzeugt wurde, wurde beobachtet, dass sich die Spermienbündel entgegen der Flussrichtung bewegten. Die Bündel nähern sich den Wänden der Mikrokanäle und die freien Köpfe im Anfangsteil des Bündels haften fest daran (Video 5). Sie haften auch an allen stationären Partikeln wie Trümmern in ihrem Weg, um dem Abdriften mit der Strömung zu widerstehen. Mit der Zeit werden diese Bündel zu langen Fäden, die andere einzelne Spermien und kürzere Bündel auffangen (Video 6). Als der Fluss langsamer wurde, begannen die langen Spermienfäden ein Netz aus Spermienfäden zu bilden (Video 7; Abb. 2).

Bei hoher Strömungsgeschwindigkeit (V > 33 µm/s) werden die Spiralbewegungen der Fäden verstärkt, um viele einzelne Spermien zu fangen und Bündel zu bilden, die der Driftkraft der Strömung besser widerstehen können. Sie versuchen auch, sich an der Seitenwand des Mikrokanals festzusetzen.

Spermienbündel wurden mittels Lichtmikroskopie (LM) als Ansammlung von Spermienköpfen und gewundenen Schwänzen identifiziert. Es wurden auch Spermienbündel mit unterschiedlichen Aggregationen identifiziert, als verdrehte Köpfe und Aggregate des Flagellums, als anhaftende Schwänze mehrerer Spermien, als Spermienköpfe, die am Schwanz befestigt waren, als Spermienköpfe mit gebogenem Kern, als mehrere aneinander haftende Spermienschwänze und als durch eine Agglutinationssubstanz zusammengeklebte Spermienköpfe mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Rasterelektronenmikroskopie (REM) zeigte ein Spermienbündel als eine Ansammlung von Spermienköpfen, die von einer Hülle bedeckt waren, wobei die Spermienansammlungen ein Netzwerk befestigter, umwickelter Schwänze aufwiesen.

Die Morphologie und Ultrastruktur der Spermien sowie die Bündelbildung wurden mittels Lichtmikroskop (Halbdünnschnitt), Rasterelektronenmikroskopie (REM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht und Samenausstriche mit gefärbt Acridinorange und mittels Epifluoreszenzmikroskopie untersucht.

Die Spermienköpfe klebten aneinander und waren mit sekretorischem Material bedeckt, wie die Acridinorange-Färbung der Spermienausstriche zeigt (Abb. 3B), was zur Bildung großer Bündel führte (Abb. 3D). Die Spermienbündel bestanden aus Spermienansammlungen, die ein Netzwerk anhaftender Schwänze aufwiesen (Abb. 4A–C). Das Spermienbündel bestand aus aneinander haftenden, umwickelten Schwänzen mehrerer Spermien (Abb. 4D). Ein Sekret (Abb. 4E,F) bedeckt die Spermienköpfe des Bündels.

Bildung von Spermienbündeln mithilfe eines Phasenkontrastmikroskops und eines mit Acridinorange gefärbten Spermienausstrichs, der zeigt, dass der Spermienkopf zusammenklebt. (A) Die frühe Bildung von Spermienbündeln begann mit Spermien (weißer Kreis) und drei Spermien (gelber Kreis), und die Spirale begann am Schwanz und schließlich am Kopf. (B) Mikroskopische Aufnahme eines mit Acridinorange gefärbten Samenausstrichs, die zeigt, dass der Spermienkopf zusammenklebt (Pfeile). Das Sekret bedeckt die Köpfe (S). Vergrößerung ×1000. (C) Die Entwicklung großer Bündel, die durch die Strömung im Mikroflüssigkeitskanal transportiert werden (unter Verwendung einer Hochgeschwindigkeitskamera mit 950 Bildern/s). (D) Mit Acridinorange gefärbte Spermienausstrich-Mikroaufnahme, die die Bildung großer Bündel zeigt (Pfeile). Vergrößerung: ×200.

Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Spermienbündeln und einem mit Acridinorange gefärbten Spermienausstrich. (A,B,D,E) sind digital kolorierte rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Spermien, während C und F mikroskopische Aufnahmen von mit Acridinorange gefärbten Spermienabstrichen sind und ein Netzwerk anhaftender, umwickelter Schwänze mehrerer Spermien zeigen. (A–C) Ansammlungen von Spermien, dargestellt als Netzwerk anhaftender Schwänze (Pfeilspitzen). (D) Mehrere Spermien anhaftender, umwickelter Schwänze (mit der agglutinierenden Substanz, rosa umrandet, Pfeile). (E und F) Spermienkopfaggregate (Pfeile), beschichtet mit einem agglutinierenden Material (Pfeilspitzen). Die Spermien bildeten Bündel mit wenigen spiralförmigen Strukturen (F). Vergrößerung von (C) ×400 und (F) ×200.

Mittels Transmissionselektronenmikroskopie zeigten wir, dass die Spermienbündel angeklebte Schwänze aufwiesen (Abb. 6A, C), wobei die Köpfe am Schwanz klebten (Abb. 6B) oder dass die Köpfe an den Schwänzen befestigt waren (Abb. 6D). Der Kopf des Spermiums im Bündel war gebogen, sodass im Schnittabschnitt zwei Abschnitte des Kerns sichtbar waren (Abb. 6D). Im Bündel im Schnittabschnitt hatten die Spermien verdrehte Köpfe mit zwei Abschnitten des Kerns und mehreren Abschnitten des Flagellums (Abb. 5A).

Digital kolorierte Transmissionselektronenmikroskopaufnahmen, die verbundene Schwänze in einem Spermienbündel und Agglutinationsmaterial zeigen, das die Spermienköpfe verbindet. (A) Anhaftende Spermienschwänze zahlreicher Spermien. Beachten Sie, wie der Schwanz in Längs- (Pfeile) und Queransichten (Pfeilspitzen) erscheint. (B) Der Kopf des Spermiums (Pfeilspitze) ist mit dem Schwanz (Pfeil) verbunden. (C) Mehrere angehängte Spermienschwänze (Pfeilspitzen). (D) Agglutinationsmaterial (AS, blaue Farbe) verbindet vier Spermienköpfe (violette Farbe).

Rasterelektronenmikroskopie wurde verwendet, um die Spermienköpfe im Bündel zu erkennen, die von einem Sekret oder einer Hülle bedeckt waren (Abb. 6B), was zeigte, dass die Spermienbündel von extrazellulären Substanzen gehalten wurden. Die agglutinierende Substanz war an den Spermienköpfen konzentriert (medusenkopfartige Anordnung; Abb. 5B) und erstreckte sich nach distal, wobei sie unter einem Fluoreszenzmikroskop ein glänzend gelbes Aussehen hatte, wenn sie mit Acridinorange gefärbt wurde (Abb. 6C). Diese Substanz ist im Rastermikroskop deutlich sichtbar und gilt als verklumpende Substanz. Halbdünne Schnitte (Abb. 5C) und mit Acridinorange gefärbte Samenabstriche zeigten, dass das Spermienbündel dicht gepackte Köpfe und gewundene Schwänze enthielt (Abb. 5D).

Verschiedene mikroskopische Aufnahmen, die die Aggregation von Spermienkopf und umwickeltem Schwanz mit verschiedenen Methoden zeigen. (A) Die digital kolorierte Transmissionselektronenmikroskopaufnahme eines Spermienbündels in einem Schnitt zeigt verdrehte Spermienköpfe mit zwei Teilen des Kerns (blaue Farbe) und mehreren Teilen des Flagellums (grüne Farbe). (B) Digital kolorierte Rasterelektronenmikroskopaufnahme, die eine Ansammlung medusenartiger Spermienköpfe zeigt, die überzogen zu sein schienen (Pfeile). (C) Halbdünnschnitte, die die Aggregation von Spermienköpfen (Pfeile) und umwickelte Schwänze (Pfeilspitzen) zeigen. (D) Die mit Acridinorange gefärbte Spermienausstrich-Aufnahme zeigt Aggregate aus Spermienköpfen (Pfeile) und umwickelten anhaftenden Schwänzen (Pfeilspitzen). Beachten Sie, dass die Klebesubstanz (S) den Spermienkopf bedeckte. Vergrößerung von (D) ×1000.

Unter Verwendung eines Transmissionselektronenmikroskops (Abb. 7A) wurde außerdem festgestellt, dass der Spermienkopf verdreht war und der Kern einer helikalen Form ähnelte, was durch mit Acridinorange gefärbte und mit einem Fluoreszenzmikroskop untersuchte Samenabstriche bestätigt wurde (Abb. 7B). ).

(A) Digitale farbige Transmissionselektronenmikroskopaufnahme und (B) mit Acridinorange gefärbter Samenausstrich, der verdrehte Köpfe und die Anheftung von Spermienköpfen und -schwänzen zeigt (Pfeil). Vergrößerung von (B) ×1000.

Interessant ist der Befund, dass Sharkasi-Spermien agglutinieren und bewegliche fadenförmige Bündel bilden. Die Eigenschaften dieser Bündel geben Aufschluss über die Rolle, die sie bei der Spermienaufnahme und -speicherung in den SSTs spielen können.

Nach der Paarung werden die Spermien in der Vagina abgelegt und durchlaufen einen intensiven Selektionsprozess, der dazu führt, dass nur eine begrenzte Anzahl von Spermien in die SSTs gelangt15,16. Bis heute ist der Mechanismus, durch den Spermien in die SSTs eindringen und diese evakuieren, unbekannt. Bei Hausgeflügel bleiben die Spermien je nach Art über einen längeren Zeitraum von 2 bis 10 Wochen in den SSTs erhalten6. Die Kontroverse bleibt hinsichtlich des Zustands der Spermien während der Lagerung in den SSTs bestehen; Befinden sie sich in einem Zustand der Bewegung oder Inaktivität? Mit anderen Worten: Wie behalten Spermien ihre Position innerhalb der SSTs über längere Zeiträume?

Forman4 schlug vor, dass der Aufenthaltsort der Spermien und der Austritt aus dem SST auf der Grundlage der Beweglichkeit der Spermien erklärt werden können. Der Autor schlug vor, dass Spermien ihre Position beibehalten, indem sie gegen einen von SST-Epithelzellen erzeugten Flüssigkeitsstrom schwimmen, und dass Spermien aus dem SST austreten, wenn ihre Geschwindigkeit unter einen Punkt fällt, an dem aufgrund von Energiemangel eine Rückzugsbewegung beginnt. Zaniboni5 bestätigte das Vorhandensein von Aquaporin 2, 3 und 9 im apikalen Teil der SSTs-Epithelzellen, was indirekt Formans Modell der Spermienspeicherung unterstützen könnte. In der aktuellen Studie haben wir herausgefunden, dass fast die Hälfte der Sharkasi-Spermien in Gegenwart einer fließenden Flüssigkeit eine positive Rheotaxis zeigen und dass agglutinierte Spermienbündel die Anzahl der Spermien mit positiver Rheotaxis erhöhen, obwohl die Agglutination ihre Geschwindigkeit verlangsamt. Wie Spermien bei Vögeln zum Eileiter aufsteigen, um die Befruchtungsstelle zu erreichen, ist nicht vollständig geklärt. Bei Säugetieren zieht die Follikelflüssigkeit Spermatozoen an7. Es wird jedoch angenommen, dass Chemo-Lockstoffe die Spermien auf eine nähere Entfernung lenken7. Daher sind für den Spermientransport andere Mechanismen verantwortlich. Es wurde berichtet, dass die Fähigkeit der Spermien, sich zu orientieren und gegen den Fluss der Eileiterflüssigkeit zu schwimmen, die nach der Kopulation abgesondert wird, ein wesentlicher Faktor für die Spermienführung bei Mäusen ist7. Parker17 ging davon aus, dass Spermien bei Vögeln und Reptilien den Eileiter durch Schwimmen gegen den Ziliarstrom durchqueren. Obwohl dies nicht experimentell in vivo bei Vögeln nachgewiesen wurde, beobachtete Adolphi18 als Erster, dass Vogelspermien eine positive Rheotaxis zeigen, wenn in einer dünnen Flüssigkeitsschicht zwischen einem Deckglas und einem Objektträger mithilfe eines Filterpapierstreifens ein langsamer Strom erzeugt wird. Hino und Yanagimachi19 installierten einen Komplex aus Eierstöcken, Eileiter und Gebärmutter der Maus in einem Perfusionshalsband und injizierten 1 µl Tusche in den Isthmus, um den Flüssigkeitsfluss im Eileiter sichtbar zu machen. Sie stellten eine sehr aktive Kontraktions- und Entspannungsbewegung im Eileiter fest, bei der sich alle Tintenbolusse gleichmäßig in Richtung der Ampulle des Eileiters bewegten. Die Autoren betonten die Bedeutung des Flusses der Eileiterflüssigkeit vom unteren zum oberen Teil des Eileiters für den Aufstieg und die Befruchtung der Spermien. Bei Hühnern und Truthähnen berichtete Brillard20, dass die Wanderung der Spermien vom Eingang zur Vagina, wo sie abgelegt werden, bis zum Uterovaginalübergang, wo sie gelagert werden, durch ihre aktive Motilität erreicht wird. Allerdings ist diese Beweglichkeit zwischen dem Uterovaginalübergang und dem Infundibulum nicht erforderlich, da der Spermientransport durch passive Verdrängung erfolgt. Mit Kenntnis dieser bisherigen Vorschläge und den Ergebnissen der aktuellen Studie kann davon ausgegangen werden, dass die Fähigkeit der Spermien, sich gegen den Strom zu bewegen (Rheotaxis), eines der Attribute ist, auf deren Grundlage der Selektionsprozess stattfindet. Und dies bestimmt den Durchgang der Spermien durch die Vagina und ihre Ankunft in den SSTs zur Lagerung. Es kann auch dazu beitragen, dass Spermien in die SSTs eindringen und sich dort für eine bestimmte Zeit aufhalten und dann wieder austreten, wenn sich ihre Geschwindigkeit zu verlangsamen beginnt, wie Forman4 vermutete.

Andererseits schlugen Matsuzaki und Sasanami21 vor, dass sich die Beweglichkeit von Vogelspermien sowohl im männlichen als auch im weiblichen Fortpflanzungstrakt von ruhend zu beweglich verändert. Als Erklärung für die verlängerte Lagerung der Spermien, auf die nach der Freisetzung aus den SSTs eine Wiederherstellung der Beweglichkeit folgt, wurde die Unterdrückung der Motilität residenter Spermien innerhalb der SSTs vorgeschlagen21. Unter hypoxischen Bedingungen berichteten Matsuzaki et al.1 über eine hohe Milchsäureproduktion und -freisetzung in den SSTs, was zu einer Unterdrückung der Motilität der vorhandenen Spermien führen kann. In diesem Fall zeigt sich die Bedeutung der Spermienrheotaxis bei der Auswahl und Aufnahme der Spermien, nicht jedoch bei der Lagerung.

Es wurde angenommen, dass der Spermienagglutinationsmodus eine plausible Erklärung für die längere Lagerungsdauer von Spermien in den SSTs darstellt, da dies das bei Hausvögeln übliche Muster des Spermienaufenthalts ist2,22,23. Bakst et al.2 beobachteten, dass die meisten Spermien aneinander haften und bündelartige Agglutinationen bilden, und einzelne Spermien sind in den SSTs von Wachteln selten zu sehen. Andererseits beobachteten Wen et al.24 mehr verstreute Spermien und weniger Spermienbündel im Lumen von SSTs bei Hühnern. Aufgrund dieser Beobachtungen kann angenommen werden, dass die Tendenz der Spermien zur Agglutination zwischen den Vogelarten und zwischen den Spermien im selben Ejakulat unterschiedlich ist. Darüber hinaus schlugen Van Krey et al.9 vor, dass die zufällige Dissoziation agglutinierter Spermien für den allmählichen Austritt von Spermien in das Lumen des Eileiters verantwortlich ist. Nach dieser Annahme sollten Spermien mit geringerer Agglutinationsfähigkeit zuerst aus den SSTs austreten. In diesem Fall könnte die Fähigkeit der Spermien zur Agglutination ein Faktor sein, der die Ergebnisse der Spermienkonkurrenz bei promiskuitiven Vögeln beeinflusst. Darüber hinaus ist die Dauer der Fruchtbarkeit umso länger, je länger die Dissoziation der agglutinierten Spermien dauert.

Obwohl in mehreren Studien2,22,24 Aggregationen von Spermien und deren Adhäsion in Bündeln beobachtet wurden, wurden sie aufgrund der Schwierigkeit, sie innerhalb der SSTs kinematisch zu beobachten, noch nicht im Detail beschrieben. Es wurden nur wenige Versuche unternommen, Spermienagglutinationen in vitro zu untersuchen. Umfangreiche, aber vorübergehende Aggregationen wurden beobachtet, wenn ein empfindlicher Draht durch einen hängenden Samentropfen herausgezogen wurde. Dadurch ragte ein längliches Vesikel aus dem Tropfen hervor und simulierte eine Samendrüse. Aufgrund dreidimensionaler Einschränkungen und der kurzen Zeit, die der Tropfen zum Trocknen benötigt, verschlechterte sich die gesamte Einheit schnell9. In der aktuellen Studie mit Sharkasi-Hühnern und einem mikrofluidischen Chip konnten wir detailliert beschreiben, wie diese Bündel entstehen und wie sie sich bewegen. Die Spermienbündel werden gebildet, sobald der Samen gesammelt wurde. Es wurde festgestellt, dass sie in einer spiralförmigen Bewegung schwimmen und eine positive Rheotaxis zeigen, wenn sie in einem Fluss vorhanden sind. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass Spermienbündel bei makroskopischer Betrachtung die Linearität der Beweglichkeit im Vergleich zu einzelnen Spermien erhöhen. Dies weist darauf hin, dass die Agglutination der Spermien vor dem Eindringen von SST erfolgen kann und dass ihre Bildung nicht, wie bereits vermutet (Tingari und Lake12), durch Druck auf einen kleinen Bereich beschränkt ist. Während der Spermienbündelbildung schwimmen die Spermien synchron, bis sie Verbindungsstellen bilden, dann werden ihre Schwänze umeinander gewickelt und die Spermienköpfe bleiben frei, aber die Schwänze und distalen Spermien werden durch eine Klebesubstanz zusammengehalten. Daher sind die freien Köpfe des Bündels für die Bewegung verantwortlich, indem sie den Rest des Bündels ziehen. Die Rasterelektronenmikroskopie von Spermienbündeln ergab anhaftende Spermienköpfe, die mit reichlich Klebesubstanz bedeckt waren, was darauf hindeutet, dass sich die Spermienköpfe in stationären Bündeln anheften, die nach Erreichen der Lagerstelle auftreten können (SSTs).

Bei der Färbung von Samenabstrichen mit Acridinorange ist die extrazelluläre Haftsubstanz, die das Sperma umgibt, unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar. Diese Substanz ermöglicht es den Spermienbündeln, an allen umgebenden Oberflächen oder Partikeln zu haften und sich daran festzuhalten, sodass sie nicht mit den umgebenden Strömungen treiben. Daher geben unsere Beobachtungen Aufschluss über die Rolle der Spermienadhäsion in Form beweglicher Bündel. Ihre Fähigkeit, gegen den Strom zu schwimmen, sowie ihre Fähigkeit, an angrenzenden Oberflächen zu haften, sorgen dafür, dass sich die Spermien über einen längeren Zeitraum in den SSTs aufhalten.

Rothschild25 verwendete eine Hämozytometerkammer, um die Schwimmverteilung von Bullenspermien in einem Suspensionstropfen zu untersuchen, indem er mikroskopische Aufnahmen durch die Kammer machte, während die optische Achse des Mikroskops vertikal und horizontal war. Die Ergebnisse zeigten, dass Spermien von den Oberflächen der Kammer angezogen werden. Die Autoren vermuteten, dass es hydrodynamische Wechselwirkungen zwischen den Spermien und den Oberflächen geben könnte. Berücksichtigt man dies und die Fähigkeit des Sharkasi-Hühnersperma, klebrige Bündel zu bilden, erhöht sich möglicherweise die Wahrscheinlichkeit, dass Spermien an den SST-Wänden haften und über einen längeren Zeitraum gelagert werden.

Baccetti und Afzeliu26 berichteten, dass die Glykokalyx der Spermien für die Gametenerkennung und -agglutination essentiell ist. Forman10 beobachtete, dass die Hydrolyse von α-glykosidischen Bindungen in der Glykoprotein-Glykolipid-Beschichtung durch die Behandlung von Geflügelspermien mit Neuraminidase zu einer verminderten Fruchtbarkeit führte, ohne die Vitalität der Spermien zu beeinträchtigen. Die Autoren spekulierten, dass die Manipulation der Glykokalyx durch Neuraminidase die Spermiensequestrierung im uterovaginalen Übergang störte, was folglich die Fruchtbarkeit verringerte. Ihre Beobachtungen konnten die Möglichkeit nicht ausschließen, dass die Neuraminidase-Behandlung die Spermien-Oozyten-Erkennung verringert haben könnte. Forman und Engel10 fanden heraus, dass die Fruchtbarkeitsrate verringert wurde, wenn Hennen intravaginal mit mit Neuraminidase behandelten Spermien besamt wurden. Allerdings hatte die intramagnale Befruchtung mit mit Neuraminidase behandelten Spermien im Vergleich zu Kontrollvögeln keinen Einfluss auf die Fruchtbarkeit. Die Autoren kamen zu dem Schluss, dass Veränderungen in der Glykoprotein-Glykolipid-Hülle, die die Spermienmembran umgibt, die Befruchtungsfähigkeit der Spermien verringern, indem sie die Spermiensequestrierung in der uterovaginalen Verbindung stören, was wiederum die Rate erhöht, mit der Spermien aus der uterovaginalen Verbindung verloren gehen, dies jedoch der Fall ist keinen Einfluss auf die Erkennung von Spermien und Eizellen.

Bei Puten fanden Bakst und Bauchan11 kleine Vesikel und Membranfragmente im Lumen von SSTs und beobachteten, dass einige dieser Partikel mit der Spermienmembran verschmolzen waren. Die Autoren spekulierten, dass diese Zusammenhänge zu einer längeren Spermienspeicherung in SSTs beitragen könnten. Die Forscher haben jedoch nicht die Quelle dieser Partikel geklärt, ob sie von den Epithelzellen von SSTs abgesondert werden, vom männlichen Fortpflanzungssystem produziert und abgesondert werden oder von den Spermien selbst. Auch ob diese Partikel für die Agglutination verantwortlich sind. Grützner et al.27 berichteten, dass die Epithelzellen des Nebenhodens ein oder mehrere spezifische Proteine produzieren und absondern, die für die Bildung von Spermienbündeln bei Monotremen benötigt werden. Die Autoren berichteten auch, dass die Ausbreitung dieser Bündel von Wechselwirkungen zwischen Nebenhodenproteinen abhängt. Nixon et al.28 fanden heraus, dass das nebenhodensekretierte Protein, das saure, cysteinreiche Osteonectin; SPARC ist an der Spermienbündelbildung sowohl beim Kurzschnabeligel als auch beim Schnabeltier beteiligt. Die Ausbreitung dieser Bündel geht mit dem Verlust dieses Proteins einher.

In der aktuellen Studie ergab die Ultrastrukturanalyse mittels Elektronenmikroskopie, dass Spermien an großen Mengen dichter Substanzen haften. Es wird angenommen, dass diese Substanzen für die Agglutination verantwortlich sind. Sie sind zwischen und um die anhaftenden Köpfe kondensiert, kommen aber in geringerer Konzentration im Schwanzbereich vor. Wir vermuten, dass diese agglutinierende Substanz vom männlichen Fortpflanzungssystem (Nebenhoden oder Samenleiter) mit dem Samen ausgeschieden wird, da wir häufig beobachtet haben, dass Spermien zum Zeitpunkt der Ejakulation aus der Lymphflüssigkeit und dem Samenplasma sequestriert werden. Es wurde berichtet, dass Geflügelspermien, wenn sie den Nebenhoden und die Samenleiter passieren, Reifungsveränderungen durchlaufen, die ihre Fähigkeit, Proteine zu binden und Plasma-Lemma-assoziierte Glykoproteine zu erwerben, unterstützen29,30. Diese Proteine bleiben auf den Membranen der in den SSTs ansässigen Spermien bestehen, was darauf hindeutet, dass diese Proteine den Erhalt der Membranstabilität der Spermien beeinflussen30 und ihre Befruchtungskapazität bestimmen31. Ahammad et al.32 berichteten, dass Spermien, die aus verschiedenen Teilen des männlichen Fortpflanzungssystems (vom Hoden bis zum distalen Samenleiter) gewonnen wurden, unter flüssigen Lagerungsbedingungen unabhängig von der Lagertemperatur allmählich steigende Überlebensraten und auch eine zunehmende Überlebensfähigkeit bei der Henne aufwiesen Eileiter nach künstlicher Befruchtung.

Die Spermienbündel von Sharkasi-Hühnern haben andere Merkmale und Funktionen als die, die bei anderen Arten wie Ameisenigeln, Schnabeltieren, Waldmäusen, Hirschmäusen und Meerschweinchen entdeckt wurden. Bei Sharkasi-Hühnern verringert die Bildung von Spermienbündeln die Schwimmgeschwindigkeit im Vergleich zu einzelnen Spermien. Diese Bündel erhöhen jedoch den Anteil der Spermien mit positiver Rheotaxis und verbessern die Fähigkeit der Spermien, sich in einer dynamischen Umgebung zu stabilisieren. Daher untermauern unsere Ergebnisse die bisherigen Annahmen, dass die Spermienagglutination bei SSTs mit einer längeren Dauer der Spermienlagerung verbunden ist. Wir spekulieren auch, dass die Tendenz der Spermien, Bündel zu bilden, die Rate des Spermienverlusts durch SSTs steuern könnte, was wiederum die Ergebnisse der Spermienkonkurrenz verändern könnte. Dieser Spekulation zufolge evakuieren Spermien mit geringer Agglutinationskapazität zuerst SSTs, während Männer mit Spermien mit hoher Agglutinationskapazität den Großteil der Nachkommen erzeugen. Die Bildung von Spermienbündeln bei Monotremen ist vorteilhaft und beeinflusst das Vaterschaftsverhältnis, allerdings über einen anderen Mechanismus. Bei Ameisenigeln und Schnabeltieren sind die Spermien parallel zueinander angeordnet, um die Vorwärtsgeschwindigkeit des Bündels zu erhöhen28. Die Beweglichkeit des Bündels ist bei Ameisenigeln etwa dreimal schneller als bei einsamen Spermien27. Die Bildung solcher Spermienbündel bei Ameisenigeln gilt als evolutionäre Anpassung zur Durchsetzung der Dominanz, da die Weibchen promiskuitiv sind und sich häufig mit mehreren Männchen paaren. Folglich stehen Spermien aus verschiedenen Ejakulaten in starker Konkurrenz um die Befruchtung der Eizellen33.

Die agglutinierten Spermienbündel bei Sharkasi-Hühnern lassen sich leicht mit einem Phasenkontrastmikroskop beobachten, was als vorteilhaft angesehen wird, da es eine einfache Untersuchung des Spermienverhaltens in vitro ermöglicht. Der Mechanismus, durch den die Bildung von Spermienbündeln die Fortpflanzung bei Sharkasi-Hühnern fördert, unterscheidet sich auch von dem Mechanismus, der bei einigen eutherischen Säugetieren beobachtet wird, die ein kooperatives Spermienverhalten zeigen, wie etwa bei Waldmäusen, wo einige Spermien altruistisches Verhalten zeigen, indem sie anderen verwandten Individuen helfen, die Eizelle zu erreichen und ihr Verhalten zu gefährden eigene Befruchtungsfähigkeit34. Ein weiteres Beispiel für kooperatives Verhalten von Spermien wurde bei Hirschmäusen entdeckt, bei denen Spermien in der Lage sind, die genetisch am stärksten verwandten Spermien zu erkennen und sich mit ihnen zu aggregieren und kooperative Gruppen zu bilden, um ihre Geschwindigkeit gegenüber nicht verwandten Spermien zu erhöhen35.

Die in dieser Studie erzielten Ergebnisse stehen nicht im Widerspruch zu Fomans Theorie zur Erklärung der Langzeitspeicherung von Spermien in SSTs. Der Forscher berichtete, dass Spermien lange Zeit in ständiger Bewegung gegen einen fließenden Strom von Epithelzellen verbringen, die die SSTs auskleiden, und dass nach einer Weile das Energiereservoir der Spermien erschöpft ist und infolgedessen die Geschwindigkeit abnimmt, was den Abfluss geringer Energie ermöglicht Spermien mit der fließenden Flüssigkeit aus dem Lumen der SSTs in das Eileiterlumen. Wir haben in der aktuellen Studie beobachtet, dass die Hälfte der einsamen Spermien die Fähigkeit besitzen, gegen fließende Flüssigkeit zu schwimmen, und dass ihre Adhäsion in Bündeln ihre Fähigkeit zur positiven Rheotaxis erhöht. Darüber hinaus widersprechen unsere Ergebnisse nicht denen von Matsuzaki et al.1, die über eine erhöhte Milchsäuresekretion in den SSTs berichteten, die die Motilität der ansässigen Spermien unterdrücken könnte. Unsere Ergebnisse beschreiben jedoch die Bildung der beweglichen Spermienbündel und ihr rheotaktisches Verhalten, wenn sie in einer dynamischen Umgebung innerhalb von Mikrokanälen vorhanden sind, als einen Versuch, ihr Verhalten in den SSTs aufzuklären. Zukünftige Forschungen werden sich wahrscheinlich auf die Identifizierung der chemischen Zusammensetzung und der Quelle des agglutinierenden Materials konzentrieren, was den Forschern zweifellos dabei helfen wird, neue Methoden zur Lagerung flüssiger Spermien und zur Verlängerung der Fruchtbarkeitsdauer zu entwickeln.

Fünfzehn dreißig Wochen alte Sharkasi-Hähne mit nacktem Hals (homozygot dominant; Na Na) wurden ausgewählt und als Samenspender in der Studie verwendet. Vögel wurden auf der Forschungsgeflügelfarm der Landwirtschaftsfakultät der Universität Assiut im Gouvernement Assiut in Ägypten gezüchtet. Die Vögel wurden in Einzelkäfigen (30 × 40 × 40 cm) gehalten, einem Beleuchtungsprogramm (16 Stunden Licht, 8 Stunden Dunkelheit) ausgesetzt und mit handelsüblichem Futter gefüttert, das 160 g Rohprotein, 2800 kcal umsetzbare Energie, 35 g Kalzium, und 5 g verfügbarer Phosphor pro kg Futter.

Gemäß36,37 wurde die Methode der Bauchmassage zur Samengewinnung von Hähnen eingesetzt. Insgesamt wurden den 15 Männern über einen Zeitraum von drei Tagen 45 Samenproben entnommen. Ejakulate (n = 15/Tag) wurden sofort mit Beltsville-Geflügelspermaverdünner 1:1 (v:v) verdünnt, bestehend aus Kaliumdiphosphat (1,27 g), Natriumglutamatmonohydrat (0,867 g), Fructose (0,5 g), wasserfreiem Natriumacetat ( 0,43 g), Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (0,195 g), Kaliumcitrat-Monohydrat (0,064 g), Kaliummonophosphat (0,065 g), Magnesiumchlorid (0,034 g) und H2O (100 ml); pH = 7,5 und Osmolalität 333 mOsm/kg38. Verdünnte Samenproben wurden zunächst unter einem Lichtmikroskop untersucht, um eine gute Spermienqualität (starke Beweglichkeit) sicherzustellen, und dann bis zur Verwendung innerhalb einer halben Stunde nach der Entnahme in einem Wasserbad bei 37 °C aufbewahrt.

Die Spermienkinematik und Rheotaxis wurden mithilfe des mikrofluidischen Gerätesystems beschrieben. Samenproben wurden in Beltsville-Geflügelsamenverdünner weiter auf 1:40 verdünnt und in das Mikrofluidikgerät geladen (siehe unten). Die kinetischen Parameter wurden mithilfe eines computergestützten Spermienanalysesystems (CASA)39 bestimmt, das zuvor für die Charakterisierung entwickelt wurde der Spermienbewegung in mikrofluidischen Umgebungen (Fakultät für Maschinenbau, Fakultät für Ingenieurwissenschaften, Universität Assiut, Ägypten). Das Plugin kann von der URL http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39 heruntergeladen werden. Gemessen wurden die krummlinige Geschwindigkeit (VCL, µm/s), die geradlinige Geschwindigkeit (VSL, µm/s) und die durchschnittliche Pfadgeschwindigkeit (VAP, µm/s). Videos von Spermien wurden mit einem inversen Mikroskop Optika Pro Probe wurden mit der CASA-Software mindestens drei Felder und 500 Spermienspuren untersucht. Aufgezeichnete Videos wurden mit einem selbst entwickelten CASA verarbeitet. Die Definition der Motilität im CASA-Plugin basiert auf der Schwimmgeschwindigkeit der Spermien im Vergleich zur Strömungsgeschwindigkeit, ohne andere Parameter wie die Seitwärtsbewegung einzubeziehen, da sich diese beim Flüssigkeitsfluss als zuverlässiger erwiesen hat. Die rheotaktische Bewegung wurde als Schwimmen der Spermien entgegen der Richtung des Flüssigkeitsflusses beschrieben. Spermien, die Rheotaxis zeigten, wurden durch die Anzahl der beweglichen Spermien dividiert; mit statischen Spermien und solche, die durch Konvektionsströmung herausgeschwemmt wurden, wurden aus der Zählung ausgeschlossen.

Sofern nicht anders angegeben, wurden alle verwendeten Chemikalien von Elgomhoria Pharmaceuticals (Kairo, Ägypten) bezogen. Das Gerät wurde mit einigen Modifikationen wie von El-sherry et al.40 beschrieben hergestellt. Zu den Materialien für die Mikrokanalherstellung gehörten Glaswafer (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25-Negativresist (MicroChem, Newton, CA), Diacetonalkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland) und Polydimethylsiloxan PDMS (Syllgard-184, Dow Corning, Midland, MI). Mikrokanäle wurden mithilfe der Soft-Lithographie41 hergestellt. Zunächst wurde eine Transparenzmaske mit dem erforderlichen Mikrokanaldesign mit einem hochauflösenden Drucker (Prismatic, Kairo, Ägypten und Pacific Arts and Design, Markham, ON) gedruckt. Master wurden unter Verwendung von Glaswafern als Substrat hergestellt. Die Wafer wurden in Aceton, Isopropylalkohol und entionisiertem Wasser gereinigt und dann durch Schleuderbeschichtung (3000 U/min, 1 Minute) mit einer 20 µm dicken Schicht SU8-25 beschichtet. Die SU-8-Schicht wurde dann weich gebrannt (65 °C, 2 Minuten und 95 °C, 10 Minuten) und 50 Sekunden lang UV-Licht ausgesetzt. Zur Vernetzung der belichteten SU-8-Schicht wurde ein Nachbelichtungsbacken für 1 Minute bei 65 °C und für 4 Minuten bei 95 °C durchgeführt, das dann 6,5 Minuten in Diacetonalkohol entwickelt wurde. Die Wafer wurden hart gebacken (200 °C für 15 Minuten), um die SU-8-Schicht weiter zu härten.

PDMS wurde durch Mischen von Monomer und Härter im Gewichtsverhältnis 10:1 hergestellt, dann in einem Vakuumexsikkator entgast und auf den SU-8-Master gegossen. PDMS wurde in einem Ofen (120 °C, 30 Minuten) ausgehärtet, und die Kanäle wurden dann geschnitten, vom Master abgezogen und gestanzt, um Schlauchverbindungen am Ein- und Ausgang der Mikrokanäle zu ermöglichen. Schließlich wurde ein tragbares Koronabehandlungsgerät (Electro-Technic Products, Chicago, IL) verwendet, um die PDMS-Mikrokanäle dauerhaft an einen Objektträger aus Mikroskopglas zu binden, wie an anderer Stelle beschrieben42. Die Abmessungen der in der vorliegenden Studie verwendeten Mikrokanäle betrugen 200 µm × 20 µm (B × H) und 3,6 cm Länge.

Durch hydrostatischen Druck induzierter Flüssigkeitsfluss im Mikrokanal wurde erreicht, indem der Flüssigkeitsspiegel am Einlassreservoir mit einem Höhenunterschied Δh39 höher gehalten wurde als am Auslassreservoir (Abb. 1).

Die durchschnittliche Geschwindigkeit innerhalb des Mikrokanals kann dann mithilfe der Darcy-Weisbach-Gleichung berechnet werden.

Dabei ist f der Reibungsfaktor, definiert als f = C/Re für laminare Strömung in einem rechteckigen Kanal, wobei C eine vom Kanalseitenverhältnis abhängige Konstante ist, L die Mikrokanallänge ist, Vav die durchschnittliche Geschwindigkeit innerhalb des Mikrokanals ist und Dh die Der hydraulische Durchmesser des Kanals und g ist die Erdbeschleunigung. Mithilfe dieser Gleichung kann die durchschnittliche Geschwindigkeit innerhalb des Kanals anhand der folgenden Gleichung berechnet werden:

Im gesamten Kanal bildet sich ein Geschwindigkeitsprofil, das für Kanäle mit einem Seitenverhältnis von weniger als 0,5 anhand der folgenden Gleichung berechnet wurde.

Dabei ist V die Flüssigkeitsgeschwindigkeit an einer beliebigen Stelle im Kanal, Vav die durchschnittliche Flüssigkeitsgeschwindigkeit, a die Kanalbreite, b die Kanalhöhe, y und z die beiden Koordinaten, gemessen von der Kanalmittellinie entlang der Kanalhöhe bzw. -breite, und m und n sind zwei numerische Faktoren, die gemäß berechnet werden

Die hydrostatische Strömungserzeugung ist eine einfache und kostengünstige Methode zur Erzeugung einer Strömung innerhalb von Mikrokanälen und weist nicht den für Spritzenpumpen typischen pulsierenden Fluss auf43. Die durchschnittliche Geschwindigkeit innerhalb des Mikrokanals kann mithilfe der Darcy-Weisbach-Gleichung44 berechnet werden. Das Geschwindigkeitsprofil innerhalb des Kanals wurde für Kanäle mit einem Seitenverhältnis von weniger als 0,545 berechnet. Die durchschnittliche Flüssigkeitsgeschwindigkeit wurde bei 33 ± 5 µm/s gehalten.

Nach der Samengewinnung und -verdünnung wurden die Proben (n = 6) in Karnovsky-Fixiermittel46 (Tabelle 1) konserviert und für jede Probe wurden zwei Aliquots für die Rasterelektronenmikroskopanalyse und die Harzherstellung von Halb- und Ultradünnschnitten hergestellt. Andere Röhrchen mit unfixierten Proben wurden verwendet, um Abstriche für die Färbung mit Acridinorange-Färbung vorzubereiten. Samenabstriche wurden mit Acridinorange-Färbung gefärbt, einem kationischen Farbstoff, der proteinhaltige Membranvesikel wie sekretorische Vesikel, membrangebundene saure Kompartimente und saure Lysosomen färbt. Acridinorange unterliegt einer metachromatischen Reaktion, die mit der Freisetzung grüner und roter Fluoreszenz verbunden ist. Acridinorange reagiert mit membrangebundenen Vesikeln und führt zu einer orangen oder roten Färbung dieser Vesikel. Acridinorange wird zum Nachweis sekretorischer Vesikel und Lysosomen verwendet47,48,49,50.

Bestandteile der Beize: Destilliertes Wasser, Acridinorange, Eisessig.

Reagenzienvorbereitung Eine Stammlösung von 50 mg Acridinorange wurde in 10 ml destilliertem Wasser hergestellt und im Kühlschrank aufbewahrt. Zur Herstellung einer Arbeitslösung wurde diese mit 1 ml Acridinorange-Stammlösung und 0,5 ml Eisessig in 50 ml destilliertem Wasser kombiniert.

Färbemethode Ein Ausstrich auf einem sauberen Objektträger und anschließendes Trocknen an der Luft. Danach wurde der Objektträger mit Methanol fixiert und erneut an der Luft getrocknet. Anschließend wird es 20 Minuten lang in eine Wanne gelegt, die eine Acridinorange-Färbe-Arbeitslösung (dh 0,01 Prozent) enthält. Die Objektträger wurden vorsichtig gewaschen und getrocknet, bevor sie mit einem Mikroskop (Modell Letiz DM 2500) mit externen Fluoreszenzeinheiten (Leica EL 6000) analysiert wurden.

Danach wurden zwei Tropfen verdünntes Sperma 2 Stunden lang bei 4 °C in Karnovsky-Fixiermittel fixiert und dann gemäß den Anweisungen von51 verarbeitet. Bei der Fixierung wurde 2 Stunden lang bei 4 °C ein äquivalentes Volumen Karnovsky-Fixiermittel auf das verdünnte Sperma aufgetragen.

Die fixierten Proben wurden zentrifugiert und das Pellet in frischem PBS-Puffer suspendiert. Dreimaliges Waschen mit Phosphatpufferlösung pH 7-2-7-4 (Tabelle 1) und nach jedem Waschen zentrifugieren

Die Proben wurden zwei Stunden lang bei Raumtemperatur zentrifugiert und in 10 % Osmiumtetroxid, hergestellt in 0–1 M Phosphatpuffer pH 7-2-7-4 und 2–5 mM Calciumchlorid, nachfixiert.

Die Proben wurden zentrifugiert und dann wurde das Pellet suspendiert und in 50 % Ethylalkohol gewaschen. Nach einer abschließenden Zentrifugation wurde das Pellet gründlich in einem kleinen Volumen 50 %igen Alkohols gemischt, in eine Pasteurpipette aufgenommen und langsam tropfenweise auf die Oberfläche eines Stapels schneller Filterpapiere (Whatman 41) verteilt.

Zwischen den Tropfen wurde die Flüssigkeit vom Filterpapier absorbiert. Dadurch bildete sich auf der Oberfläche des Filterpapiers ein „Haufen“ aus Zellmaterial, das mit einem feinen Spatel entfernt und auf einer 2–4 %igen Agarplatte abgelegt werden konnte. Bei 60 °C wurde das Material mit geschmolzenem Agar bedeckt.

Nach der Entfernung des zusätzlichen Agars, der die Probe umgab, wurde der „Materialblock“ wie folgt behandelt: 52,53: mit aufsteigenden Ethanolalkoholen (70 %, 90 p %, 100 %, 100 %) dehydriert und eingebettet in Epon-Araldit. Die Blöcke wurden mit einer Mischung aus Ethanol und Propylenoxid dehydriert. Die Blöcke wurden 30 Minuten lang, 70 Minuten über Nacht, 90 Minuten lang, 30 Minuten lang mit 100 % I und 60 Minuten lang mit 100 % II dehydriert.

Die Harzeinbettung erfolgte unter Verwendung von Propylenoxid (Merck, Darmstadt, Deutschland) für 30 Minuten, Epon:Propylenoxid (Verhältnis etwa 1:1) für 30 Minuten und Epon für 3 Stunden. Epon wurde durch Kombination von 5 ml Epon 812 (Polysciences, Eppelheim, Deutschland) mit 5 ml Araldit und 12 ml DDSA erzeugt.

Zur Implantation der Blöcke wurde Epon verwendet, die dann bei 60 °C inkubiert wurden. Zur Polymerisation der Proben (1,5 %) wurden eine Epon-Mischung und ein Beschleuniger (DMP-30) verwendet. Die Blöcke wurden 3 Tage lang bei den folgenden Temperaturen inkubiert: 60 °C am ersten Tag, 70 °C am zweiten Tag und 75 °C am dritten Tag.

Toluidinblau wurde verwendet, um halbdünne Schnitte (1 Mikrometer) anzufärben, die mit einem Ultramikrotom Ultra Cut E (Reichert Leica) geschnitten wurden (Natriumtetraborat [Borax] 1 g, Toluidinblau 1 g und destilliertes Wasser 100 ml)54. Die gefärbten Schnitte wurden mit einem Leitz Dialux 100 Mikroskop untersucht. Die Fotos wurden mit einer Canon-Digitalkamera (Canon Power Shot A95) aufgenommen.

Wir haben Portionen mit Spermienbündeln aus Halbdünnschnitten ausgewählt, um Ultradünnschnitte herzustellen. Zum Schneiden ultradünner Portionen wurde ein Ultrotom® V verwendet (LKB Bromma, München, Deutschland). Die 70-nm-Schnitte wurden mit Uranylacetat und Bleicitrat55 gefärbt und mit einem JEOL100CX II-Transmissionselektronenmikroskop an der Elektronenmikroskopie-Einheit der Assiut-Universität in Assiut, Ägypten, untersucht.

Die Entwicklung der Spermienbündel wurde mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM) beobachtet. Die Probenvorbereitung erfolgte gemäß56 wie folgt: Jede Probe wurde 4 Stunden lang bei 4 °C in Karnovsky-Fixiermittel (Tabelle 2)46 fixiert. Die Proben wurden dann zentrifugiert und im gleichen Fixierungspuffer gewaschen (5 Mal), bevor sie 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in 1 % Osmiumsäure in 0,1 M Na-Phosphatpuffer nachfixiert wurden. Sie wurden 15 Mal mit 0,1 M Phosphatpuffer gespült. Zum Trocknen der Proben wurden aufsteigende Qualitäten von Ethanolalkohol mit Konzentrationen von 50, 70, 90 und 100 Prozent verwendet (30 Minuten in jeder Konzentration). Jede Probe wurde auf einem Aluminiumfolienschiffchen verteilt, befestigt und dann an der Luft getrocknet. Abschließend wurden die Proben mit einem Ionensputtergerät JEOL1100 E mit Gold beschichtet und mit einem JEOL-Rasterelektronenmikroskop (JSM5400 LV) bei KV10 untersucht.

Um die genaue Struktur zu erkennen, haben wir die raster- und Transmissionselektronenmikroskopischen Bilder in Photoshop digital eingefärbt. Viele Autoren haben diese Methode bereits angewendet55,56,57,58,59,60,61,62.

Alle Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Zum Vergleich der Mittelwerte wurde die Kruskal-Wallis-ANOVA auf Rängen verwendet, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleichen. Alle Statistiken wurden entweder mit Hilfe von JMP v5.0.1 (SAS Campus Drive, Cary, NC, USA) oder der GraphPad Prism v5-Software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) berechnet. Unterschiede von P < 0,05 wurden als signifikant angesehen.

Wir verwendeten die Kruskal-Wallis-ANOVA, um die Einzelspermien- und Bündelbewegungen zu vergleichen, die verschiedene Stichprobengrößen aufwiesen. Mit dieser Methode werden zwei oder mehr unabhängige Stichproben gleicher oder unterschiedlicher Stichprobengröße verglichen.

Alle im Rahmen dieser Untersuchung erstellten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten und auf Anfrage bei den Autoren erhältlich.

Matsuzaki, M. et al. Milchsäure ist ein Faktor, der die Spermienmotilität in den Spermienspeicherkanälchen inaktiviert. Wissenschaft. Rep. 5, 1–12 (2015).

Artikel Google Scholar

Bakst, MR, Wishart, G. & Brillard, J.-P. Auswahl, Transport und Lagerung eiförmiger Spermien bei Geflügel. Geflügel. Wissenschaft. Rev. 5, 117–143 (1994).

Google Scholar

Khillare, G. et al. Molekulare und biochemische Ereignisse in den Spermienspeicherröhrchen des Eileiters bei Vögeln. Weltgeflügel. Wissenschaft. J. 74, 35–44 (2018).

Artikel Google Scholar

Froman, D. Herleitung eines Modells zur Spermienspeicherung im Eileiter des Hausgeflügels (Gallus Domesticus). Biol. Reproduktion. 69, 248–253 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zaniboni, L. & Bakst, M. Lokalisierung von Aquaporinen in den Spermienspeicherkanälchen im Eileiter der Pute. Geflügel. Wissenschaft. 83, 1209–1212 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bakst, M. Symposium über Physiologie und Endokrinologie: Rolle des Eileiters bei der Aufrechterhaltung einer nachhaltigen Fruchtbarkeit bei Hühnern. J. Anim. Wissenschaft. 89, 1323–1329 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Miki, K. & Clapham, DE Rheotaxis steuert Säugetierspermien. Curr. Biol. 23, 443–452 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zaferani, M., Cheong, SH & Abbaspourrad, A. Rheotaxisbasierte Trennung von Spermien mit progressiver Motilität mithilfe eines mikrofluidischen Korralsystems. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. 115, 8272–8277 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Van Krey, H., Balander, R. & Compton, M. Lagerung und Evakuierung von Spermatozoen aus den uterovaginalen Spermienwirtsdrüsen bei Hausgeflügel. Geflügel. Wissenschaft. 60, 871–877 (1981).

Artikel PubMed Google Scholar

Froman, DP & Engel, HN Jr. Veränderung der Spermatozoen-Glykokalyx und ihre Auswirkung auf die Fruchtbarkeitsdauer beim Geflügel (Gallus Domesticus). Biol. Reproduktion. 40, 615–621 (1989).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bakst, MR & Bauchan, G. Apikale Bläschen auf Mikrovilli der Spermienspeicherröhrchen der Epithelzellen: Ihre Freisetzung und Interaktion mit residenten Spermien im Eileiter der Putenhenne. Theriogenology 83, 1438–1444 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

Tingari, M. & Lake, P. Ultrastrukturelle Studien an den uterovaginalen Spermien-Wirtsdrüsen der Haushenne GallusDomesticus. Reproduktion 34, 423–431 (1973).

Artikel CAS Google Scholar

Brillard, J., Beaumont, C. & Scheller, M. Physiologische Reaktionen von Hühnern, die unterschiedlich nach der Anzahl der Küken ausgewählt wurden, die aus einer einzigen Besamung hervorgingen. Reproduktion 114, 111–117 (1998).

Artikel CAS Google Scholar

Mero, K. & Ogasawara, F. Abmessungen der uterovaginalen Spermienspeicherkanälchen des Huhns und ihre mögliche Bedeutung für die Spermienfreisetzung. Geflügel. Wissenschaft. 49, 1304–1308 (1970).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Brillard, J. & Bakst, M. Quantifizierung von Spermien in den Spermienspeicherkanälchen von Putenhennen und die Beziehung zur Spermienzahl in der perivitellinen Schicht von Eiern. Biol. Reproduktion. 43, 271–275 (1990).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Brillard, J. Lagerung und Transport von Spermien nach natürlicher Paarung und künstlicher Befruchtung. Geflügel. Wissenschaft. 72, 923–928 (1993).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Parker, GH VII. Der Durchgang von Spermien und Eiern durch die Eileiter bei Landwirbeltieren. Philos. Trans. R. Soc. London. Ser. B enthalten. Brei. Biol. Charakter. 219, 381–419 (1931).

ADS Google Scholar

Adolphi, H. Über das Verhalten der Wirbeltierspermatozoen in strömenden Flüssigkeiten. Anat. Anz 28, 138–149 (1906).

Google Scholar

Hino, T. & Yanagimachi, R. Aktive peristaltische Bewegungen und Flüssigkeitsproduktion des Eileiters der Maus: Ihre Rolle beim Flüssigkeits- und Spermientransport und bei der Befruchtung. Biol. Reproduktion. 101, 40–49 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Brillard, J. Verschiebungen von Spermien im Eileiter bei Henne und Truthahn. Repr. Nutr. Entwickler 30, 175–182 (1990).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Matsuzaki, M. & Sasanami, T. Regulierung der Spermienmotilität im Genitaltrakt männlicher und weiblicher Vögel. J. Poult. Wissenschaft. 0200105 (2021).

Bakst, M. & Richards, M. Konzentrationen ausgewählter Kationen in Truthahnserum und Eileiterschleimhäuten. Geflügel. Wissenschaft. 64, 555–563 (1985).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ito, T. et al. Progesteron ist ein Spermienfreisetzungsfaktor aus den Spermienspeicherkanälchen bei Vögeln. Endokrinologie 152, 3952–3962 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wen, C. et al. Schädliche Auswirkungen einer übermäßigen Fettsäuresekretion auf die weibliche Spermienspeicherung bei Hühnern. J. Anim. Wissenschaft. Biotechnologie. 11, 1–13 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Rothschild,. Nicht zufällige Verteilung von Bullenspermien in einem Tropfen Spermiensuspension. Natur 198, 1221 (1963).

Artikel ADS Google Scholar

Baccetti, B. & BA, A. Die Biologie der Samenzelle (1976).

Grützner, F., Nixon, B. & Jones, R. Reproduktionsbiologie bei eierlegenden Säugetieren. Sex. Dev 2, 115–127 (2008).

Artikel PubMed Google Scholar

Nixon, B. et al. Bildung und Dissoziation von Spermienbündeln bei Monotremen. Biol. Reproduktion. 95, 91–11 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Esponda, P. & Bedford, J. Die Oberfläche des Hahnsperma verändert sich beim Durchgang durch den Wolffschen Gang. J. Exp. Zool. 234, 441–449 (1985).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Morris, S. et al. Spezifität der Spermien-bindenden Wolffian-Gang-Proteine beim Hahn und ihre Persistenz auf Spermien in den weiblichen Wirtsdrüsen. J. Exp. Zool. 242, 189–198 (1987).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wishart, G. & Steele, M. Der Einfluss der Spermienoberflächeneigenschaften auf die Spermienfunktion im weiblichen Fortpflanzungstrakt. Der Einfluss der Eigenschaften der Spermienoberfläche auf die Spermienfunktion im weiblichen Fortpflanzungstrakt. 101–112 (1990).

Ahammad, MU et al. Reifungsbedingte Veränderungen der Überlebensfähigkeit und Fruchtbarkeit von Geflügelspermien während ihrer Passage durch den männlichen Fortpflanzungstrakt. Anim. Reproduktion. Wissenschaft. 128, 129–136 (2011).

Artikel PubMed Google Scholar

Jones, RC, Dacheux, JL, Nixon, B. & Ecroyd, HW Rolle des Nebenhodens bei der Spermienkonkurrenz. Asiatischer J. Androl. 9, 493–499 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Moore, H., Dvorakova, K., Jenkins, N. & Breed, W. Außergewöhnliche Spermienkooperation bei der Waldmaus. Natur 418, 174–177 (2002).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Fisher, HS & Hoekstra, HE Wettbewerb fördert die Zusammenarbeit zwischen eng verwandten Spermien von Hirschmäusen. Natur 463, 801–803 (2010).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mosenene, TMB Charakterisierung und Kryokonservierung von Sperma von vier südafrikanischen Hühnerrassen, University of the Free State Bloemfontein (2009).

Cole, HH & Cupps, PT Reproduktion bei Haustieren (1977).

Telnoni, S., Arifiantini, RI, Yusuf, T. & Darwati, S. SK Kedu-Sperma-Kryokonservierung in Beltsville-Geflügel-Sperma-Extender und Laktat-Ringer-Eigelb-Extender unter Verwendung von Dimethylsulfoxie. Asiatischer J. Poult. Sci 11, 14–19 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Elsayed, M., El-Sherry, TM & Abdelgawad, M. Entwicklung eines computergestützten Spermienanalyse-Plugins zur Analyse der Spermienbewegung in mikrofluidischen Umgebungen mit Image-J. Theriogenology 84, 1367–1377 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

El-Sherry, TM & Abdelgawad, M. Charakterisierung der Rheotaxis von Bullenspermien mittels Mikrofluidik. Integr. Biol. 6, 1111–1121. https://doi.org/10.1039/c4ib00196f (2014).

Artikel Google Scholar

Duffy, DC, McDonald, JC, Schueller, OJA & Whitesides, GM Rapid Prototyping von Mikrofluidsystemen in Poly(dimethylsiloxan). Anal. Chem. 70, 4974–4984 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Haubert, K., Drierb, T. & Beebe, D. PDMS-Bonding mittels eines tragbaren, kostengünstigen Koronasystems. Lab Chip 6, 1548–1549 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Moscovici, M., Chien, W.-Y., Abdelgawad, M. & Sun, Y. Stromfreies, druckbetriebenes Pumpen mit geringem Totvolumen für mikrofluidische Anwendungen. Biomicrofluidics 4, 046501 (2010).

Artikel PubMed Central Google Scholar

Munson, BR, Young, DF & Okiishi, TH Fundamentals of Fluid Mechanics 4. Aufl. (Wiley, 2002).

MATH Google Scholar

Shah, RK & London, AL Laminare Strömung erzwungene Konvektion in Kanälen; Ein Quellenbuch für analytische Daten zu Kompaktwärmetauschern (Academic Press, 1978).

Google Scholar

Morris, JK Ein Formaldehyd-Glutaraldehyd-Fixiermittel mit hoher Osmolalität zur Verwendung in der Elektronenmikroskopie. J. Cell Biol. 27, 1A-149A (1965).

ADS Google Scholar

Abd-Elhafeez, HH, Abou-Elhamd, AS & Soliman, SA Morphologischer und immunhistochemischer Phänotyp von TCs im Darmkolben von Graskarpfen und ihre mögliche Rolle bei der Darmimmunität. Wissenschaft. Rep. 10, 1–17 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Abd-Elhafeez, HH, Abou-Elhamd, AS, Abdo, W. & Soliman, SA Migrationsaktivitäten und Stammzelleneigenschaften von Stäbchenzellen. Mikrosk. Mikroanal. 26, 1035–1052 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Soliman, SA, Kamal, BM, Abuo-Elhmad, AS & Abd-Elhafeez, HH Morphologische und histochemische Charakterisierung der Hautplatten von Pleco (Hypostomus plecostomus). Mikrosk. Mikroanal. 26, 551–566 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

El-Bab, M., Abdelhafeez, H., Soliman, S. & Kamal, B. Identifizierung von Trachealknorpelkanälen bei Kamelen. PSM Tierarzt. Res. 3, 99–105 (2019).

Google Scholar

Ryder, T. & Mackenzie, ML Routinemäßige Vorbereitung von Samenflüssigkeitsproben für die Transmissionselektronenmikroskopie. J. Clin. Pathol. 34, 1006–1009 (1981).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Abd-Elhafeez, HH & Soliman, SA Neue Beschreibung der Telozytenhüllen im Rinder-Uterusrohr: Eine immunhistochemische und rastermikroskopische Studie. Zellen Gewebe Organe 203, 295–315 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Abd-Elhafeez, H. & Soliman, S. Herkunft von Stäbchenzellen und Kartierung ihrer Verbreitung im Rubinrotflossenhai (Regenbogenhai) Epalzeorhynchos frenatum (Teleostei: Cyprinidae): Licht-, Immunhistochemie- und Ultrastrukturstudie. J. Cytol. Histo. 7, 435 (2016).

Google Scholar

Suvarna, S. & Layton, C. Bancrofts Theorie und Praxis histologischer Techniken, 7. Aufl. (Elsevier, 2013).

Google Scholar

Reynolds, ES Die Verwendung von Bleicitrat bei hohem pH-Wert als elektronenundurchlässiger Farbstoff in der Elektronenmikroskopie. J. Cell Biol. 17, 208–212 (1963).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yousef, MS, Abd-Elhafeez, HH, Talukder, AK & Miyamoto, A. Ovulatorische Follikelflüssigkeit induziert Spermienphagozytose durch Neutrophile, aber Eileiterflüssigkeit um die Brunst unterdrückt in vitro ihre entzündliche Wirkung im Büffel-Eileiter. Mol. Reproduktion. Entwickler 86, 835–846 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Abd-Elhafeez, HH, Hassan, AHS & Hussein, MT Die Verabreichung von Melatonin provoziert die Aktivität dendritischer retikulärer Zellen in der Samenbläschen von Soay-Schafböcken während der Nichtbrutzeit. Wissenschaft. Rep. 11, 1–20 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Abd-Elhafeez, HH, Abdo, W., Kamal, BM & Soliman, SA Fischtelozyten und ihre Beziehung zu Stäbchenzellen beim Rubinrotflossenhai (Regenbogenhai) Epalzeorhynchos frenatum (Teleostei: Cyprinidae). Wissenschaft. Rep. 10, 1–18 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Abdel-Maksoud, FM, Abd-Elhafeez, HH & Soliman, SA Morphologische Veränderungen von Telozyten in efferenten Ductuli von Kamelen als Reaktion auf saisonale Schwankungen während des Fortpflanzungszyklus. Wissenschaft. Rep. 9, 1–17 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Soliman, SA, Kamal, BM & Abd-Elhafeez, HH Zellinvasion und Matrixabbau, eine andere Art von Matrix abbauenden Zellen im Knorpel von Welsen (Clarias gariepinus) und japanischen Wachtelembryonen (Coturnix coturnix japonica). Mikrosk. Mikroanal. 25, 1283–1292 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Abdel-Hakeem, SS, Mahmoud, GA-E. & Abdel-Hafeez, HH Bewertung und Mikroanalyse parasitärer und bakterieller Erreger von frischem ägyptischem Sushi und Salmo salar. Mikrosk. Mikroanal. 25, 1498–1508 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Mustafa, FE-ZA & Elhanbaly, R. Histologische, histochemische, immunhistochemische und ultrastrukturelle Charakterisierung der Hoden der Taube. Zygote 29, 33–41 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

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Professor Dr. Jeff Downing, Adjunct Associate Professor an der University of Sydney, Australien, war für die gründliche englische Bearbeitung verantwortlich, die die Arbeit erheblich bereichert hat, und die Autoren möchten ihm danken.

Open-Access-Finanzierung durch die Science, Technology & Innovation Funding Authority (STDF) in Zusammenarbeit mit der Egyptian Knowledge Bank (EKB).

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Taymour M. El-Sherry, Hanan H. Abd-Elhafeez und MAM Sayed.

Abteilung für Theriogenologie, Fakultät für Veterinärmedizin, Universität Assiut, Assiut, 71526, Ägypten

Taymour M. El-Sherry

Abteilung für Zellen und Gewebe, Fakultät für Veterinärmedizin, Universität Assiut, Assiut, 71526, Ägypten

Hanan H. Abd Elhafeez

Abteilung für Geflügelproduktion, Fakultät für Landwirtschaft, Universität Assiut, Assiut, 71526, Ägypten

MAM sagte

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Die Arbeit wurde zu gleichen Teilen unter den Autoren aufgeteilt. TME, MAMS, HHA, einschließlich Forschungsstudie, Datenanalyse und -interpretation, Bildanordnung und Papierschreiben. Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Hanan H. Abd-Elhafeez.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

El-Sherry, TM, Abd-Elhafeez, HH & Sayed, MAM Neue Erkenntnisse zur Spermienrheotaxis, -agglutination und -bündelbildung bei Sharkasi-Hühnern basierend auf einer In-vitro-Studie. Sci Rep 12, 13003 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17037-x

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Eingegangen: 23. Oktober 2021

Angenommen: 20. Juli 2022

Veröffentlicht: 29. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17037-x

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