Design eines neuartigen integrierten Mikrofluidikchips zur kontinuierlichen Trennung zirkulierender Tumorzellen von peripheren Blutzellen

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 17016 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Krebs ist weltweit eine der häufigsten Todesursachen. In entwickelten Ländern sind die Präsentation im Spätstadium, die schwer zugängliche Diagnose und Behandlung häufige Herausforderungen. Der frühestmögliche Nachweis und die Zählung zirkulierender Tumorzellen (CTC) können Berichten zufolge zu einer wirksameren Behandlung führen. Die Isolierung von CTC in einem frühen Stadium ist aufgrund der geringen Wahrscheinlichkeit seines Vorkommens im peripheren Blut eine Herausforderung. In dieser Studie schlagen wir ein neuartiges zweistufiges, markierungsfreies, schnelles und kontinuierliches CTC-Trenngerät vor, das auf hydrodynamischer Trägheitsfokussierung und dielektrophoretischer Trennung basiert. Die Dominanz und Differenzierung der wandinduzierten Trägheitsauftriebskraft und der Dean-Widerstandskraft innerhalb eines gekrümmten Mikrofluidikkanals führt zu einer größenbasierten Trennung von roten Blutkörperchen (RBC) und Blutplättchen (Größe zwischen 2–4 µm) von CTC und Leukozyten (9– 12,2 µm). Mithilfe eines numerischen Modells wurde der Mechanismus der hydrodynamischen Trägheitsfokussierung in einem krummlinigen Mikrokanal untersucht. Simulationen wurden mit Erythrozyten, Blutplättchen, CTCs und Leukozyten (vier Hauptuntertypen) durchgeführt, um den optimierten Wert der Parameter im vorgeschlagenen Design auszuwählen. In der ersten Stufe wurde das Fokussierungsverhalten von Zellen im Mikromaßstab untersucht, um Leukozyten und CTCs von Erythrozyten und Blutplättchen zu trennen, während in der zweiten Stufe lebensfähige CTCs anhand ihrer inhärenten elektrischen Eigenschaften mithilfe von Dielektrophorese von Leukozyten getrennt wurden. Das vorgeschlagene Design des Geräts wurde anhand numerischer Simulationen auf die Effizienz der CTC-Trennung hin bewertet. Diese Studie untersuchte den Einfluss kritischer Faktoren wie Seitenverhältnis, dielektrophoretische Kraft, Kanalgröße, Durchflussrate, Trenneffizienz und Form auf die Zelltrennung. Die Ergebnisse zeigen, dass das vorgeschlagene Gerät lebensfähiges CTC mit einer Isolationseffizienz von 99,5 % und einem Durchsatz von 12,2 ml/h liefert.

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) und des Global Cancer Observatory wird die Zahl der neuen Krebsfälle pro Jahr bis 2040 voraussichtlich auf 29,5 Millionen und die Zahl der krebsbedingten Todesfälle auf 16,4 Millionen steigen1,2. In den meisten Fällen wird Krebs erst dann diagnostiziert und behandelt, wenn Tumorzellen im ganzen Körper Metastasen gebildet haben3. Anschließend erleidet der Patient kurzzeitig einen Rückfall mit einer sehr geringen Überlebensrate. Zirkulierende Tumorzellen (CTCs) sind Zellen, die sich von Primärtumoren, Rezidiven oder Metastasen lösen, im peripheren Blut zirkulieren und antigene und genetische tumorspezifische Eigenschaften besitzen4. CTCs können zu einem sekundären Wachstum von Tumoren an anderen Stellen des Körpers führen, das als Metastasen bezeichnet wird4. CTCs haben unterschiedliche morphologische und molekulare Eigenschaften; Sie treten bereits in einem sehr frühen Stadium der Tumorentwicklung im Vollblut auf5. Es wurde festgestellt, dass die Diagnose, Überwachung und personalisierte Krebstherapie von Krankheiten durch die Führung eines CTC-Kontos6 erfolgen kann. Vor diesem Hintergrund ist es wichtig, seltene CTCs (einen nicht-invasiven Marker) zu erkennen und zu bewerten, um die Krankheit früh genug für eine wirksame Behandlung zu diagnostizieren7. Die Zählung von CTCs aus Vollblut ist sehr anspruchsvoll, da sie bei Patienten in frühen Krebsstadien selten sind, d 106 Leukozyten9. Für die weitere nachgelagerte Genotyp- und Phänotypanalyse zur Bestimmung des Krebsfortschritts sind lebensfähige CTCs erforderlich. Die heterogene Morphologie von Krebszellen macht ihre Isolierung technisch schwierig10. Zur Charakterisierung und Isolierung lebensfähiger CTCs wird ein Zellsortiergerät mit hoher Empfindlichkeit benötigt. Der Nachweis von CTC aus Vollblut, der oft als „Flüssigkeitsbiopsie“ bezeichnet wird, hat die Aufmerksamkeit der wissenschaftlichen und klinischen Gemeinschaft auf sich gezogen11, da diese Methode Potenzial für Diagnose, Prognose und Bewertung der Behandlungswirksamkeit bietet12. Bisher wurden mehrere Methoden zum Nachweis und zur Isolierung von CTCs entwickelt13,14,15,16,17,18,19,20. Isolationstechniken nutzen die biophysikalischen Eigenschaften von CTC, die sie von Vollblut unterscheiden. Mikrofluidische Zellsortierer werden am häufigsten für diagnostische Zwecke eingesetzt. Mithilfe der Mikrofluidiktechnologie werden Flüssigkeitstransportprozesse in Mikrokanälen untersucht. Zu den Vorteilen zählen die geringe Probengröße, die kurze Reaktionszeit und die geringen Kosten. Zur Durchführung biologischer Analysen wurden Lab-on-Chip (LOC)-Geräte mit integrierten Funktionen entwickelt, die auf der gleichen Technologie basieren21,22,23. Mikrofluidische Zellsortierer werden allgemein als aktiv oder passiv klassifiziert. Aktive Techniken nutzen externe Stimulation wie elektrische, magnetische, optische, akustische und biochemische usw.22. Bei passiven Techniken wird keine äußere Kraft angewendet, sondern sie nutzen intrinsische Eigenschaften wie Größe, Form, Kanalarchitektur und hydrodynamische Kräfte23. Einige Techniken erfordern eine Markierung der CTCs vor der Trennung24,25. Proben werden mit bestimmten Zelloberflächenmarkern markiert, zum Beispiel Fluoreszenzmarkierung, Vorfärbung, Anheftung usw., um eine Zählung und Visualisierung nach der Trennung zu ermöglichen. Der Schwerpunkt der Forscher lag auf der Entwicklung von CTC-Zählungs- und Nachweismethoden, einschließlich des CellSearch-Systems. Große Anstrengungen wurden unter Verwendung spezifischer Immunmarkierungstechniken für Epithelzellen unternommen, beispielsweise EpCAM oder verschiedene Zytokeratine. Es besteht jedoch das Risiko, dass sie die CTCs verlieren, die kein EpCAM exprimieren oder einen Übergang vom Epithel zum Mesenchym (EMT) durchlaufen haben4,26,27.

Passive Trägheitstrennmethoden bieten eine markierungsfreie Trennung mit hohem Durchsatz und sind mit einfachen und robusten Designs28 ausgestattet, was sie vielversprechender macht. In der Trägheitsmikrofluidik induzieren geometrische Änderungen, beispielsweise krummlinige Geometrien und Kontraktions-Expansions-Arrays (CEA), eine transversale sekundäre Dean-Strömung in den Mikrokanälen, um Zellen basierend auf ihren physikalischen Eigenschaften zu trennen. Diese hydrodynamische Trennung nutzt eine massive Hochdurchsatzfiltration von Blutzellen und kann eine sehr hohe Durchflussrate bewältigen. Trotz der Beliebtheit passiver Methoden weisen diese bestimmte Einschränkungen auf, z. B. Leukozytenkontamination in CTCs aufgrund von Zellgrößenüberlappungen bei größenbasierter Trennung29; Aufgrund unterschiedlicher Geometrien für verschiedene Zielzellen basiert das Design in der Regel auf Proben30. Aktive Methoden, insbesondere die Dielektrophorese (DEP), nutzen ein variierendes externes elektrisches Feld und die intrinsische elektrische Leitfähigkeit von Zellen, um CTCs zu trennen. DEP ist eine aktive Technik, die Zellen anhand ihrer Größe und elektrischen Eigenschaften trennt. Die DEP-Kraft bezieht sich auf die Kraft, die durch ein ungleichmäßiges elektrisches Feld auf das induzierte Dipolmoment eines dielektrischen und/oder leitfähigen Teilchens ausgeübt wird31,32,33. Normale periphere Blutzellen und CTCs aller Arten von Krebs und soliden Tumoren zeigen konsistente dielektrische Unterschiede, wenn sie unterschiedlichen elektrischen Feldern ausgesetzt werden17,19,34,35. Daher kann DEP CTCs aus einem breiteren Spektrum von Zellen genau isolieren. Für diese Isolierung sind keine Zelloberflächenmarkierungsprotokolle erforderlich. Da isolierte CTCs unverändert oder lebensfähig sind, können sie zur molekularen Charakterisierung verwendet werden, um das Fortschreiten des Krebses zu bestimmen, was im Allgemeinen bei der Entwicklung einer wirksameren personalisierten Therapie hilft. Unter Ausnutzung der unterschiedlichen elektrischen Eigenschaften zwischen CTC und anderen Blutzellen wurden bestimmte DEP-basierte Sortierer bei der Erkennung von Tumorzellen verschiedener Typen wie Darm-, Brust-, Prostata- und Lungenkarzinomen eingesetzt. Die meisten DEP-basierten Techniken verwendeten binäre, versetzte Proben und nicht das Vollblut36,37,38,39. Die Probenvorbereitung für diese Geräte ist recht umständlich und kompliziert, während andererseits auch die Handhabung von Vollblut eine große Herausforderung darstellt. Obwohl die DEP-Technik eine genaue CTC-Isolierung ermöglicht, gibt es aufgrund der hohen Leitfähigkeit des Bluts gewisse Einschränkungen wie einen geringen Durchsatz40 und eine verringerte Trenneffizienz für die Chip-basierte DEP-Mikrofluidik41. Darüber hinaus führt DEP zu einer Erwärmung innerhalb des Geräts, was zu einer Veränderung der elektrischen Eigenschaften der Zelle und zu Zellschäden führt42.

Unter Berücksichtigung der individuellen Einschränkungen und Vorteile aktiver und passiver Techniken wurden hybride Mikrofluidikgeräte vorgeschlagen. Die Einführung mehrerer Kräfte durch die Kombination aktiver und/oder passiver Methoden führte zu einer hohen Reinheit, einer hohen Empfindlichkeit der getrennten Zellen und einem größeren Betriebsbereich der Geräte, während gleichzeitig die Einschränkungen beider Techniken überwunden wurden22. In der verfügbaren offenen Literatur kombinierten viele Forscher DEP mit vielen aktiven und/oder passiven Methoden, um die Effizienz der CTC-Isolierung zu verbessern. DEP wurde auch neben anderen aktiven Techniken eingesetzt, beispielsweise magnetophoretisch, akustophoretisch und optophoretisch. Zunächst wurde DEP mit der Feldflussfraktionierung (FFF) kombiniert, bei der das Zellgleichgewicht mithilfe hydrodynamischer und DEP-Kräfte erreicht wird. Zellen werden anhand ihrer Dichte und dielektrischen Eigenschaften getrennt und die dynamischen physikalischen Eigenschaften von Tumorzellen wurden gemessen43.

In einer früheren Studie von Moon und Kollegen wurde DEP mit der Multi-Orifice-Flow-Fraktionierungstechnik (MOFF) kombiniert, um MCF-7-Brustkrebszellen mit einer hohen Flussrate von 126 µl/min von Erythrozyten und Leukozyten zu trennen39,44. Die Probe wurde unter Verwendung von Leukozyten und Erythrozyten hergestellt, die durch Zentrifugation von Vollblut und versetzten CTCs gewonnen wurden. Die Trenneffizienz von CTCs in der berichteten Studie betrug 75,18 %, was auf den CTC-Verlust bei der seriellen Trennung und die Erythrozytenkontamination zurückzuführen ist. Sie hatten eine ziemlich lange Konfiguration (ca. 10 cm).

Apostream, ein Gerät, das DEP mit einer Methode der passiven Feldflussfraktionierung (FFF) kombiniert, verwendete mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMNs), die aus 7,5 ml normalem menschlichem Blut isoliert wurden, und versetzte Tumorzellen in Eierstockkrebs-SKOV3- und Brustkrebs-MDA-MB-231-Zellen Es. Die berichtete durchschnittliche Rückgewinnung von Tumorzellen mit diesem Gerät betrug 75,4 % ± 3,1 % und 71,2 % ± 1,6 %11. Obwohl die Trennung verbessert wurde, hatte das beschriebene Gerät bestimmte Probleme wie einen begrenzten Durchsatz und eine Zellüberlastung, die zu Dipol-Dipol-Wechselwirkungen, Clusterbildung und Vermischung von Zellen führte.

Der DEP-FFF hat aufgrund der Batch-Modus-Verarbeitung einen begrenzten Durchsatz. Eine Forschungsgruppe stellte eine Mikrofluidikplattform mit kontinuierlichem Durchfluss vor, die 160 mm lang und 25 mm breit war. Die Probe wurde unter Verwendung vormarkierter MDA-MB-231-Brustkrebszellen hergestellt, die in PBMNs versetzt wurden. Es hat eine durchschnittliche Trenneffizienz von 75 % und ist in der Lage, 10-ml-Proben in weniger als einer Stunde zu verarbeiten45. Die große Konfiguration wirft jedoch die Frage auf, ob der gleiche Zweck mit einer kürzeren Anordnung erreicht werden könnte. Eine andere Forschungsgruppe präsentierte eine DEP-inertial gekoppelte Plattform zur Partikeltrennung. Sie verwendeten Polystyrolpartikel unterschiedlicher Größe in einem Serpentinenkanal mit vertikaler negativer DEP (n-DEP). Die DEP-Kraft lässt die Partikel schweben und ihre Fokussierung kann vertikal erfolgen, indem die Flussrate und die Spannung in Echtzeit geändert werden, ohne dass eine Neukonstruktion erforderlich ist. Sie berichteten von einer Abscheideleistung von 100 % bzw. 96 % für 13 µm bzw. 5 µm große Partikel46,47. Es wurde über ein integriertes Zelltrennungssystem unter Verwendung von Hydrophorese neben DEP48 berichtet. Bei der Hydrophorese werden hydrodynamische Druckgradienten durch Mikrostrukturen induziert, um die Partikel in Suspension zu manipulieren. Das Hydrophoresemodul basierte auf einem Serpentinenkanal mit Mikrostrukturen und DEP wurde mithilfe einer schrägen Elektrodenanordnung aufgetragen. Das System wurde getestet, um Astrozyten-beeinflusste Zellen von neuralen Stammzellen der Maus mit einer Flussrate von 3,5 ul/min zu trennen49. Es wurde festgestellt, dass die Zell-Zell-Interaktion signifikant wird, wenn der Hämatokritwert des Blutes 1 % überschreitet50. Die Überladung kann durch Verdünnung der Blutprobe behoben werden, jedoch nur bis zu 1:10, da sich bei Überschreitung dieses Verhältnisses der pH-Wert des Blutes ändert und die Blutzellen dazu veranlasst werden, ihre biologischen Eigenschaften (Zellmembran) zu ändern51.

Die elektrische Leitfähigkeit des Blutes und sein Hämoglobinspiegel stehen in direktem Zusammenhang52. Wenn Hämoglobin aus dem Vollblut abgetrennt wird, werden die Zellüberladung und die Joule'sche Erwärmung reduziert. Daher gehen wir davon aus, dass die Abtrennung von Erythrozyten, die Hämoglobin enthalten, aus dem Vollblut die Leitfähigkeit, die Zellüberladung und die Joule-Erwärmung während der DEP-Abtrennung der verbleibenden Probe verringert. Durch die frühzeitige Trennung von Erythrozyten und Blutplättchen aus der Probe wird das Problem der Zell-Zell-Interaktion umgangen, da der Hämatokritwert sinkt. Dies könnte auch die Verarbeitungszeit der CTC-Isolierung verkürzen. Darüber hinaus verursacht eine längere Exposition gegenüber dem elektrischen Feld auch Stress in den Zellen, der durch eine Voranreicherung von CTC und Leukozyten aus anderen Blutzellen wie Erythrozyten und Blutplättchen reduziert werden kann. Dies kann durch Hinzufügen einer Vorverarbeitungsstufe zum DEP-Sorter auf einer einzigen Plattform erreicht werden. Bestehende Techniken nutzen eine Zentrifugationsplattform zur Voranreicherung vor dem Sortieren nach DEP. Frühere Studien berichteten jedoch über Zellverlust aufgrund der durch das Spinnen verursachten Zytotoxizität53. Darüber hinaus führt eine Verzögerung der Zentrifugation zur Vermischung von Blut und Gradientenmedium. Hochgeschwindigkeitszentrifugation belastet die Zellen und aktiviert und verändert so die Protein- und Genexpression von Leukozyten54. In ähnlicher Weise moduliert die magnetische Sortierung der Blutprobe zur Entfernung roter Blutkörperchen die Oberflächenproteinexpression vieler Krebsarten, insbesondere derjenigen, die ihren Ursprung im Epithelgewebe haben, was die Isolierung aufgrund sich verändernder Oberflächenantigene erschwert55,56. In der Trägheitsmikrofluidik sind Parameter, die den Sekundärfluss steuern, die Reynolds-Zahl Re, die Dean-Zahl K und das Seitenverhältnis des Kanals AR57. Somit können durch Manipulation dieser Parameter verschiedene Geräte mit gewünschter Effizienz und Leistung entwickelt werden. Es ist allgemein anerkannt, dass ein Gerät eine CTC-Analyse für ein klinisch relevantes Verfahren für eine Probe in zwei Stunden durchführen sollte58,59. Wir gehen davon aus, dass mit einer Kombination dieser Geometrien und der Manipulation des Dean-Flusses die Konfiguration kürzer sein könnte und der Trennprozess in vergleichsweise kürzerer Zeit stattfinden würde. Aufgrund der Knappheit der CTCs und der Komplikationen bei der Handhabung peripherer Blutproben verwenden die meisten Forscher binäre oder versetzte Proben, um ihre vorgeschlagenen Geräte zu testen. Eine solche Praxis ist möglicherweise nicht gültig, wenn man sie mit den Ergebnissen der Vollblutprobe vergleicht.

In diesem Forschungsartikel wurden alle oben genannten Probleme, einschließlich Zellüberladung, Zell-Zell-Interaktion, Joule-Erwärmung, Modulation der Oberflächenproteinexpression, Zellverlust und Verarbeitungszeit, mithilfe eines anderen in DEP integrierten Trennmechanismus in einer mikrofluidischen Umgebung angegangen. Wir schlagen hier ein neuartiges zweistufiges seriell integriertes Mikrofluidikgerät vor, um Erythrozyten und Blutplättchen mithilfe von Trägheitsfokussierung aus dem Vollblut zu trennen und anschließend CTCs mithilfe von DEP aus Leukozyten zu isolieren. Die vorgeschlagene Hybridmethode verwendet peripheres Blut als Input. Das Gerät wurde entwickelt, um die Zellüberladung zu reduzieren, den Durchsatz und die Reinheit zu erhöhen, da es die Vorteile mehrerer Methoden vereint. Durch die Hinzufügung einer weiteren Stufe wird das Risiko eines Probenverlusts eliminiert und die Isolationseffizienz im Vergleich zu bestehenden Methoden verbessert. Ziel dieser Studie ist die Entwicklung eines mikrofluidischen Geräts zum Nachweis von Glioblastom (GBM)-Tumorzellen. GBM-Zellen besiedeln durch Diffusion die normale Gehirnregion, und ein Versagen bei der Erkennung führt zu einer chirurgischen Unheilbarkeit und der Patient erliegt innerhalb von 14,2 Monaten60. In der offenen Literatur wurde ein solches Hybrid-DEP-Gerät zur Isolierung von GBM-Zellen nicht diskutiert.

Der Rest dieses Dokuments ist wie folgt gegliedert: Abschnitt II erläutert das Konzept und Design des vorgeschlagenen Geräts, Modellierungs- und Simulationsdetails werden in Abschnitt III bereitgestellt. Die wichtigsten Ergebnisse, die damit verbundene Diskussion und die Optimierung der Entwurfsparameter werden in Abschnitt IV vorgestellt. Die Schlussfolgerungen finden Sie in Abschnitt V.

Das vorgeschlagene Design besteht aus einem seriell integrierten kombinierten krummlinigen Trägheitsfokussierungskanal (passive Stufe) und einem DEP-Sortierkanal (aktive Stufe). Die erste Stufe verfügt über zwei Einlässe, einen für die Probeninjektion und einen für den Fokussierungsfluss, dh Pufferlösung. Die injizierte Probe und der Puffer folgen der entworfenen kombinierten Geometrie bis zum Bifurkationsbereich, von wo aus getrennte CTCs und Leukozyten an die zweite Stufe abgegeben werden, während sich Erythrozyten und Blutplättchen im Abfallauslass ansammeln. Der Einlass der zweiten Stufe ist symmetrisch zum Auslass der ersten Stufe konfiguriert, um die kontinuierlichen Strömungsfeldbedingungen aufrechtzuerhalten. In der zweiten Stufe werden hGBM-Zellen selektiv über DEP isoliert. Die zweite Stufe besteht aus zwei Einlässen, einem Elektrodensatz und zwei Auslässen. Der erste Einlass dieser Stufe ist mit dem Auslass der ersten Stufe verbunden, sodass die getrennten Zellen zum Eingang der zweiten Stufe werden. Ein weiterer Einlass dient der Injektion eines Puffers. Ein Auslass ist für die CTC-Sammlung und der andere für WBCs (Abfallauslass) vorgesehen. Abbildung 1 zeigt das mikrofluidische Gerät mit einer integrierten passiven und aktiven Stufe.

Die schematische 3D-Darstellung des entwickelten Geräts mit beiden eingebetteten Stufen. Sobald die Blutprobe durch den Einlass eingeführt wird, werden die meisten Blutzellen, einschließlich Erythrozyten, Blutplättchen, T-Lymphozyten und B-Lymphozyten, in der Trägheitsfokussierungsstufe und der zweiten Stufe abgetrennt. Abschließend werden die seltenen zirkulierenden Tumorzellen mittels DEP selektiv abgetrennt und über Auslass II gesammelt. Restliche WBCs treten durch den Abfallauslass III aus.

Wenn die Flüssigkeit in den gekrümmten rechteckigen Kontraktionsbereich eintritt, erfahren die darin enthaltenen Partikel Trägheitsauftriebskräfte und Dean-Widerstandskräfte. Die Richtung und das Ausmaß der Partikelwanderung hängen von der Partikelgröße und dem Gleichgewicht zwischen diesen Kräften ab. Da die Kanalbreite größer als die Höhe ist, wird zwischen den oberen und unteren Teilen eine höhere Schergeschwindigkeit induziert als zwischen den Seitenwänden. Dies führt aufgrund starker Trägheitsauftriebskräfte zu einer Bewegung der Partikel in Richtung des oberen und unteren Teils des Kanals. Daher kann durch Ändern der Kanalseitenverhältnisgröße eine Trägheitstrennung aufgrund der Änderung der Scherrate und damit der Trägheitsauftriebskraft erreicht werden.

Die inertialen Fokussierungsströme werden durch drei Hauptkräfte bestimmt: eine durch die Wand induzierte Kraft, eine Schergradienten-Auftriebskraft und eine sekundäre Strömungswiderstandskraft. Eine Zelle, die durch einen Mikrokanal fließt, interagiert mit seinen Wänden, was dazu führt, dass sie sich (a) langsamer als die Flüssigkeit bewegt und (b) zwischen Zelle und Wand einen Druck aufbaut, der eine der Kanalwand entgegengesetzte Kraft entwickelt. Diese Kraft ist umgekehrt proportional zum Abstand zwischen dem Partikel und der Kanalwand. Die Gl. 1 beschreibt die wandinduzierte Auftriebskraft61 als:

Dabei ist v das Verhältnis der Flüssigkeitsdichte ρ zur Flüssigkeitsviskosität µ, r der Partikelradius, D der Abstand zwischen den Kanalwänden, s der nichtdimensionalisierte Abstand vom Partikel zur Referenzwand, d/D, sodass 0 < s ist < 1 für Partikel im Kanal, D1 und D2 sind Funktionen des nichtdimensionalen Wandabstands s, n ist die Wandnormale am nächstgelegenen Punkt auf der Referenzwand, I ist die Identitätsmatrix und v ist die Fluidgeschwindigkeit.

Da das typische mikrofluidische Geschwindigkeitsprofil parabolisch ist, ist eine Zelle gleichzeitig Geschwindigkeiten unterschiedlicher Größenordnung ausgesetzt, was dazu führt, dass die Flüssigkeit eine Kraft auf die Zelle in Richtung zunehmender Scherung, d. h. Kanalwand, ausübt. Diese Kraft wird in Gleichung dargestellt. 2.

wobei C konstant ist, \(D_{h} = \frac{2wh}{{w + h}}\) der hydraulische Durchmesser ist (w ist die Breite des Expansionsbereichs und h die Höhe des Mikrofluidikkanals), vm ist der maximale Kanalgeschwindigkeit. Diese Gleichung zeigt, dass diese Kraft von der Reynolds-Zahl des Kanals und der Partikelposition abhängt, jedoch unabhängig von der Partikelrotation ist. Diese in der Simulation verwendete Schergradientenauftriebskraft wird von62 bereitgestellt. Unter der Annahme einer Partikel-Reynolds-Zahl < 1 und einer parabolischen Strömung wird die Gesamtgröße dieser Auftriebskräfte von Evgeny63 bereitgestellt

wobei \(G\) die lokale Scherrate und \(f_{L}\) als Auftriebskoeffizient definiert ist. Diese Funktion hängt von der Partikelposition im Kanal und der Reynolds-Zahl des Kanals ab. Bei Sekundärströmungen dienen sie der Steuerung der Anzahl der Gleichgewichtslagen innerhalb eines gegebenen Kanalquerschnitts. Gleichung 4 zeigt die von diesen Sekundärströmungen ausgeübte Widerstandskraft. Unter der Annahme des Stokes-Widerstands ist er durch 64 gegeben.

wobei R der Krümmungsradius des gekrümmten Kanals ist. Diese Widerstandskraft ist direkt proportional zur Sekundärströmungsgeschwindigkeit und der Zellgröße. Sie steht jedoch im umgekehrten Zusammenhang mit dem Krümmungsradius des gekrümmten Bereichs des Kanals und der Reynolds-Zahl des Kanals.

Das vorgeschlagene Design nutzt gekrümmte und CEA-Elemente und daher variieren die Kräfte, wenn sich die Geometrie ändert. Das Gleichgewicht zwischen diesen beiden Kräften bestimmt die endgültigen Gleichgewichtspositionen der Partikel. Die Partikel tendieren dazu, sich unter der Wirkung des Trägheitsauftriebs zwischen der Kanalwand und der Mitte anzusiedeln. Gleichung 3 zeigt, dass die Kraft linear mit dem Zellradius skaliert. Dadurch bewegen sich große Partikel in Richtung der Kanalwand. Sobald sie dort sind, bleiben diese Zellen von der Dean-Widerstandskraft unbeeinflusst und behalten einen Abstand von der vertikalen Mitte des Kanals bei. Kleinere Zellen werden von der Trägheitsauftriebskraft nicht beeinflusst und bewegen sich daher unter der Wirkung der radial gerichteten Dean-Strömung in Richtung Zentrum. Dadurch werden die Zellen am Kanalausgang entsprechend ihrer Größe getrennt.

Das Verhältnis der akkumulierten Auftriebs- und Widerstandskräfte \(\frac{{F_{L} }}{{F_{D} }}\) ist der bestimmende Faktor dafür, wo sich eine Zelle mit einem bestimmten Durchmesser im Kanal durch Identifizierung ins Gleichgewicht bringt das, was die Kraft dominiert. Wenn das Verhältnis > > 1 ist, erfolgt eine Trägheitsfokussierung der Mikropartikel, während bei < < 1 die Dean-Widerstandskraft die Partikel mischt65,66. Gleichung 3 zeigt, dass die Intensität der Trägheitsmigration von Systemparametern abhängt und direkt proportional zur zweifachen Zellgröße ist. Daher neigen Zellen mit großem Durchmesser dazu, sich in Richtung der Kanalwand zu bewegen und eine Gleichgewichtsposition irgendwo zwischen der Wand und der Mitte zu erreichen. Die Zell-/Partikelfokussierung durch die dominante Trägheitsauftriebskraft hängt stark vom Verhältnis ap/Dh ab, wobei ap der Zelldurchmesser ist64,67. In diesem Verhältnis ist der hydraulische Durchmesser aufgrund der Änderung der Kanalhöhe bei gleichen Bedingungen der Reynoldszahl ein wichtiger Faktor. Gemäß unserem vorgeschlagenen Ansatz und unserer Hypothese könnte eine vorherige effiziente Trennung der roten Blutkörperchen und Blutplättchen (Größe ~ 2–4 µm) aus dem Vollblut die CTC-Isolierung und -Gewinnung im DEP-Stadium erleichtern. Den Erkenntnissen von Lee et al.68 zufolge ermöglicht ein CEA-Mikrokanal mit niedrigem Aspektverhältnis die Trennung von Partikeln mit einem Durchmesser von weniger als 4 µm bei hoher Durchflussrate und hohem Durchsatz. Daher haben wir uns für ein niedriges Seitenverhältnis des Kontraktionsbereichs des Trägheits-Mikrofluidikkanals entschieden. Unter Berücksichtigung der Durchmesser aller Zielzellen haben wir zunächst verschiedene mikrofluidische Curve-CEA-Kanäle mit niedrigem Seitenverhältnis (AR = H/W) und einer Kanalhöhe im Bereich von 40–100 µ entworfen. Wir untersuchten das Verhalten der Zellfokussierung, indem wir den Effekt der Modulation der Trägheitskraft quantitativ untersuchten. Das ap/Dh-Verhältnis von CTCs bei einem Seitenverhältnis von 0,8–2 wurde mit 0,17–0,07 berechnet.

Nach der Trennung vom Rest der Blutzellen gehen CTCs mit restlichen Blutzellen (hauptsächlich Monozyten und Granulozyten) in die zweite Stufe über, in der eine aktive Technik angewendet wird, um CTCs genau von Leukozyten zu isolieren. Die DEP-Kraft bezieht sich auf die Kraft, die durch ein ungleichmäßiges elektrisches Feld auf das induzierte Dipolmoment eines dielektrischen und/oder leitfähigen Teilchens ausgeübt wird69. Die Kraft wirkt nur, wenn ein Unterschied zwischen der Permittivität des Teilchens und der der umgebenden Flüssigkeit besteht. Die Intensität der dielektrophoretischen Kraft auf die Partikel hängt vom Permittivitätsgradienten zwischen der Suspension und den Partikeln ab. Wenn eine biologische homogene Kugelzelle mit dem Radius rp in einem variierenden elektrischen Feld platziert wird, während sie in einem Medium schwebt, kann die gesamte dielektrophoretische Kraft unter Vernachlässigung höherer Polarisationsordnung auf 70 geschätzt werden

wobei ε0 = 8,854187817 × 10−12 F/m die Permittivität des Vakuums ist, Re(CM) der Realteil des Clausius-Mossotti-Faktors ist, der die Frequenzvariation der effektiven Polarisierbarkeit des Teilchens im Medium beschreibt44,69. Dies hängt von den komplexen Permitivitäten der Zellen, dem Suspensionsmedium und der Frequenz des von außen angelegten elektrischen Felds70,71 ab. Da es eine Funktion der Frequenz des elektrischen Feldes ist, spielt es eine wichtige Rolle im Trennprozess. Biologische Zellen sind aufgrund der Lipiddoppelschicht-Zellmembran sowie intrazellulärer Strukturen und Flüssigkeiten nicht homogen. Um den CM-Faktor zu berechnen, haben wir daher ein Einzelschalenmodell von70 in Betracht gezogen, bei dem eine Zelle als Partikel mit einer dünnen Außenschicht (Hülle) oder Zellmembran angenommen wird . Es wird angenommen, dass das Volumen innerhalb der dünnen Schichten oder intrazellulären Strukturen und der Flüssigkeit eine gleichmäßige Leitfähigkeit und Permittivität aufweist, die Eigenschaften der Zellmembran können sich jedoch erheblich von denen des Rests der Zelle unterscheiden. Im Einzelschalenmodell wird bei der Berechnung des DEP die äquivalente komplexe relative Permittivität eines homogenen Partikels, das sowohl die Zellmembran als auch das Zytoplasma der Zelle umfasst, anstelle der komplexen Permittivität des Partikels angewendet. Wenn die komplexe Permittivität von Zellen größer wird als die der Suspensionsflüssigkeit \(\varepsilon_{p}^{*} > \varepsilon_{f}^{*}\), wird dies als positive DEP bezeichnet und zieht die Zellen an Elektroden. Im Gegensatz dazu stößt negatives DEP die Zellen oder Partikel aus dem Bereich eines hohen elektrischen Feldes ab.

In dieser Studie wird negative DEP-Abstoßung in Kombination mit hydrodynamischer Fokussierung verwendet. Der Trennmechanismus bei der DEP-Trennung besteht darin, eine Wechselstromfrequenz zu finden, bei der die CTCs nDEP erfahren, während die übrigen anderen Leukozyten entweder positive DEP oder keine DEP erfahren (Cross-Over-Frequenz). Die auf die Zellen wirkende DEP-Kraft ist proportional zu ihrem Zellvolumen. Die auf die Zellen wirkende Gesamtkraft \(F_{T} = { }F_{DEP} - f\nu ,\) ist durch die dielektrophoretische Kraft gegeben, der die hydrodynamische Widerstandskraft entgegenwirkt. Dabei ist f die Stokes-Widerstandskraft und für kleine Reynolds-Zahlen gegeben durch f = 6πηr, ν ist die Strömungsgeschwindigkeit der Zellsuspension. Da Zellen als starre kugelförmige Objekte in einem Medium mit der Viskosität η behandelt werden, ist die durch DEP verursachte Geschwindigkeit proportional zum Quadrat des Zellradius. Die Flugbahn des Teilchens wird nach Berechnung der Kräfte im Strömungsfeld geschätzt. Die Bewegung von Zellen in einer Flüssigkeit folgt dem zweiten Newtonschen Bewegungsgesetz72. Die Nettokraft auf eine Zelle im DEP-Stadium wird wie folgt angegeben:

Dabei ist mp die Zellmasse, \({\text{v}} = d{\text{q}}/dt\) die Zellgeschwindigkeit und q die Position der Zelle, FL, FD, Fdp und Fvm sind Auftrieb, Widerstand, Druckgradient bzw. virtuelle Massenkräfte. Der CM-Faktor gibt das Vorzeichen der DEP-Kraft basierend auf der Arbeitsfrequenz an. Abbildung 2 zeigt den CM-Faktor anhand eines Einzelschalenmodells für hGBM- und IV-Leukozytentypen im Vergleich zur angewandten Häufigkeit. Die Intensität der dielektrophoretischen Kraft auf die Partikel hängt vom Permittivitätsgradienten zwischen der Suspension und den Partikeln ab. Die DEP-Stufe besteht aus einem Satz ineinandergreifender Elektroden entlang des Hauptkanals für die Zellsuspension und zwei Auslässen für CTCs sowie dem Abfallkanal für Leukozyten. Die geeignete Spannung und Frequenz werden so gewählt, dass der CTC, wenn er sich den Elektroden nähert, eine nDEP-Kraft erfährt, die dazu führt, dass er sich aus dem Bereich des hohen elektrischen Feldes weg und schließlich zum Ausgang bewegt. Währenddessen durchlaufen die Leukozyten eine pDEP und bewegen sich in Richtung des anderen Auslasses. Da in der ersten Stufe der größte Teil des Blutgehalts (nicht Newton) entfernt wurde, wurde für die zweite Stufe 0,1 × Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) mit einer niedrigen Leitfähigkeit von 0,055 S/m und einer relativen Permittivität von 78 ausgewählt. Die Geschwindigkeit der Partikel wurde durch eine Vergrößerung der Kanalbreite von 50 auf 175 µm verringert. Durch diese Geschwindigkeitsreduzierung konnten alle Zellen der DEP-Kraft ausgesetzt werden. Dadurch wurde auch das elektrische Feld über den Kanalquerschnitt verringert, was zu einer Entnahme lebensfähiger Zellen führte und die Zellisolierung an den Auslässen erleichterte.

Der reale Teil des Claussius-Mossotti-Faktors (CM) von hGBM und Subtypen von Leukozyten wird mithilfe eines Einzelschalenmodells gegen die angewandte Häufigkeit abgebildet.

COMSOL Multiphysics v5.5 wird zur Modellierung des Geräts verwendet und ein Finite-Analyse-Modul wurde zur Durchführung der Computational Fluid Dynamics (CFD)-Simulation verwendet. COMSOL bietet eine integrierte grafische Benutzeroberfläche (GUI), über die Modelle erstellt und gelöst werden können, indem vordefinierte Physikmodule verwendet werden, die für bestimmte Anwendungsbereiche optimiert sind. Wir verwendeten Module für Fluidströmung, mikroelektromechanische Systeme (MEMS) und elektrische Schaltkreise. Das Ziel der 2D- und 3D-Modellierung bestand darin, das Strömungsfeld zu berechnen, die Kräfte zu validieren und den Trennprozess innerhalb des vorgeschlagenen Geräts zu visualisieren. Das CAD-Geometriemodell wurde mithilfe der integrierten Geometriefunktion von COMSOL entwickelt.

Das vorgeschlagene Design der gekrümmten CEA-Trägheitstrennstufe ist von der Arbeit von Shamloo et al. inspiriert. Die anfängliche Breite des gekrümmten Bereichs beträgt 50 μm und die Länge 1950 μm, während die Breite des Erweiterungsbereichs 350 μm und die Länge 700 μm beträgt. Die Kanalhöhe beträgt 50 μm.

Nach dem Geometrieentwurf bestand der nächste Schritt darin, das domänenweise Material des Modells zu definieren. Obwohl COMSOL durch eine riesige Materialbibliothek ergänzt wird, wurden zur Entwicklung eines realistischen Gerätedesigns, das für klinische Tests verwendet werden könnte, die physikalischen Parameter menschlicher Blutproben, die mit beiden Trennstufen verbunden sind, aus der Literatur73,76,77,78 und deren Werte extrahiert sind in Tabelle 1 aufgeführt. Diese Studie konzentrierte sich auf Hirntumorzellen oder menschliche Glioblastomzellen (hGBM), für die in der offenen Literatur keine vorherige DEP-Trennung berichtet wurde.

Im COMSOL Model Builder wurden Strömungssimulationseigenschaften im mikrofluidischen Bereich definiert. Um eine Ansammlung von Zellen um einen scharfkantigen Bereich herum zu vermeiden, die aufgrund mehrerer Bereiche mit Nullgeschwindigkeit auftritt, wurden gekrümmte Kanten verwendet. Da spitze Kanten und scharfe Ecken für die Zelltrennungseffizienz nicht optimal waren75. Die Vernetzung wurde sorgfältig durchgeführt, um Fehler wie invertierte Netzelemente zu vermeiden. Um die scharfen und gekrümmten Bereiche des Kanals herum wurde eine sehr feine Vernetzung vorgenommen. Um den Rechenbereich der vorgeschlagenen Geometrie zu diskretisieren, wurde ein gleichmäßiges tetraedrisches Strukturnetz verwendet. Zur Diskretisierung der Geometrie der Inertialstufe wurde ein strukturiertes Netz verwendet. Es wurde eine Netzunabhängigkeitsanalyse mit 145.046, 177.149 und 669.078 Gittern oder Elementen durchgeführt (Abb. 3). Eine zufriedenstellende Konvergenz der Ergebnisse wurde mit Elementgrößen zwischen 1,28 für feinere und 11,9 μm für gröbere Maschen erzielt. Die maximale Fehlerquote bezogen auf die angegebene Anzahl an Elementen betrug < 1 %.

Die Geschwindigkeitsverteilung (y-Komponente) entlang der vertikalen Linie in der Mitte des erweiterten Bereichs zeigt die Geschwindigkeitsschwankung im angegebenen Bereich des Mikrofluidikkanals. Die Netzkonvergenzanalyse wurde mit 145.046, 177.149 und 669.078 Elementen oder Gittern durchgeführt, d. h. (gröbere, normale und feinere Netzeinstellungen). Das Liniendiagramm zeigt die Netzkonvergenz für die Gittergröße von 1,28 µm.

Die Finite-Elemente-Methode (FEM) wurde mithilfe des Fluidströmungsmoduls implementiert. Die Ergebnisse der Laminarströmungssimulation wurden als Input für das Partikelverfolgungsmodul verwendet. Dies wiederum erzeugte die Partikelbahn im entworfenen mikrofluidischen Bereich. Anschließend wurden die maßgeblichen PDEs mithilfe der Simulationssoftware gelöst. Für die Strömungsfeldverteilung wurden die Navier-Stokes-Gleichung und Impulsgleichungen (nichtlineare Konvektion-Diffusion) gelöst. Für ein niedriges Seitenverhältnis gilt ap/Dh als < 1, daher wurde eine Durchflussrate zwischen 120 und 200 µl/min gewählt. Die beiden Einlässe wurden durch Flussraten von 20 bzw. 200 μl/min für eine Blutprobe bzw. einen Fokussierungsfluss definiert. An den Auslässen des Mikrofluidikkanals wurde eine Nulldruck-Randbedingung und für Wände eine rutschfeste Randbedingung angewendet. Die Galerkin-Formulierung der kleinsten Quadrate wurde verwendet, um die maßgeblichen nichtlinearen PDEs mit einem System gewöhnlicher Differentialgleichungen (ODEs) zu approximieren. Für die Flüssigkeitsströmung wurde eine laminare Strömung mit Diskretisierung (P2 + P2) gelöst. Daraus ergeben sich die Netto-Trägheitsauftriebs- und Widerstandskräfte zusammen mit der virtuellen Masse und der Druckgradientenkraft, die im Partikelverfolgungsmodul zur Schätzung der Bewegung der Zelle verwendet werden. Für die am Einlass einzuspritzende Blutprobe wird eine Zellgruppe mit sieben Zelllinien ausgewählt: 24 Erythrozyten, 12 Plts, 12 Leukozyten (Granulozyten, Monozyten, T-Lymphozyten, B-Lymphozyten) und 3 CTCs. Die oben genannte (verkleinerte) Zellzahl basierte auf der tatsächlichen Menge derselben Zellen im menschlichen Blut. Im Partikelverfolgungsmodul wurde eine zeitabhängige Studie mit einem Zeitschritt von 0,0001 s durchgeführt. Die Bewegungsgleichungen wurden unter Berücksichtigung der Stokes-Widerstandskraft mit Wandkorrekturen, der Auftriebskraft einschließlich wandinduziertem und Schergradienten, der virtuellen Masse und der Druckgradientenkraft gelöst.

Die in dieser Studie für den Modellvergleich verwendete Primärgeometrie besteht aus einem gekrümmten Bereich und einem Erweiterungsbereich. Die anfängliche Breite des gekrümmten Bereichs beträgt 50 μm und die Länge 1950 μm, während die Breite des Erweiterungsbereichs 350 μm und die Länge 700 μm beträgt. Die Kanalhöhe beträgt 50 μm. Für die Kontraktionszone wird ein Seitenverhältnis (AR = H/W) von 1 gewählt. Diese Menge wurde sorgfältig ausgewählt, da sie für eine ordnungsgemäße Trennung von entscheidender Bedeutung ist. Zunächst wurde die Simulation mit nur zwei Modellpartikeln der Größe 4 und 10 µm auf der Primärgeometrie durchgeführt (Abb. 4) und die Ergebnisse mit den von Shamloo et al.79 berichteten Ergebnissen verglichen, die in Abb. 5 erläutert wurden. Die Trenneffizienz kann als das Verhältnis des am CTC-Auslass erhaltenen CTC zur Gesamtmenge des am Einlass eingespritzten CTC bestimmt werden. Das simulierte Modell beschreibt die Lage der maximalen Zellkonzentration bei einem Trennspalt. Um die Zelltrennung zu visualisieren, wurden die Partikel anhand ihrer Größe in Abb. 4 eingefärbt.

Simulationsergebnisse für die Primärgeometrie mit einer einzelnen kontrahierten, gekrümmten und erweiterten AR-Architektur mit niedrigem Seitenverhältnis. Modellpartikel mit einer Größe von 4 und 10 µm wurden mit der Hüllströmung injiziert. Die Simulation zeigt die Trennung der Partikel mit sichtbarer Trennlücke.

Vergleich der Ergebnisse der Primärgeometriesimulation mit den in der Literatur verfügbaren Daten. In der durchgeführten Simulation wurde festgestellt, dass der durchschnittliche Trennabstand zwischen 4 und 10 µm großen Partikeln und die Ausbeute größer waren. Die Reinheit beider Zellgrößen entsprach jedoch den gemeldeten Daten.

Der Vergleich ist sinnvoll, aber aufgrund der unterschiedlichen untersuchten Zellgrößen und der seriellen Integration der DEP-Stufe funktionierte das gleiche Design nicht für die hGBM-Trennung. Nachdem das Analyseverfahren der Trägheitsfokussierungsphase festgelegt wurde, wird das maßgeschneiderte Design für die Erythrozyten- und Plt-Trennung von WBCs und CTCs durch Einbeziehung geometrischer Änderungen fertiggestellt. Bifurkationsauslässe unterschiedlicher Größe und Form wurden für die Trennung und Sammlung der Erythrozyten und Plts entworfen und getestet , WBC und CTC. Das ursprüngliche Design der Auslässe basierte auf dem Trennspalt zwischen den Zielzellen. Zentrifugaleffekt und Zweifach-Fung-Bifurkationsgesetz80. Abbildung 6a–d zeigt unterschiedliche Designs von Auslässen und zeigt die Änderung der Trenneffizienz und Reinheit. Das in (d) dargestellte Design zeigte die beste Trennfestigkeit und bestätigte gleichzeitig die vorherigen Ergebnisse. Daher wurde das Bifurkationsdesign (d) für die Trägheitsfokussierungsphase ausgewählt, wobei der obere Auslass für die zurückgewiesenen Erythrozyten und Plt vorgesehen ist, während der andere für den Transport von CTC und WBC zur weiteren Trennung verwendet wird. Nachdem das Design fertiggestellt war, wurden mehrere Simulationen durchgeführt, um die Trenneffizienz und -reinheit zu bestimmen, dh das Verhältnis der Anzahl der im gewünschten Auslass gesammelten Zellen zur Gesamtzahl der Zellen in diesem Auslass. bei unterschiedlichen Seitenverhältnissen.

Unterschiedlich gestaltete Ausgänge unterstreichen die Auswahl der Trägheitsfokussierungsphase. Zur Visualisierung der Abscheideleistung werden die Partikel entsprechend ihrer Größe eingefärbt. (a) Auslässe werden basierend auf der Konzentrationslücke der Partikel im ursprünglichen Modell entworfen. (b) Auslassgrößen geändert (c) Größe des Abfallauslasses vergrößert (d) Die symmetrische Gabelung der Auslässe führt zu einer effektiven Trennung von CTC vom Rest der Blutzellen.

Wir haben beobachtet, dass die Zellen anfangen zu fokussieren, wenn die Trägheitskraft über der Dean-Widerstandskraft um ap /Dh ~ 0,1 dominiert. Daraus können wir vorhersagen, dass die CTC-Trennung von anderen Blutzellen bei der entworfenen gekrümmten CEA-Geometrie unter 70 μm Höhe und mit einer Reynolds-Zahl Re über 18 erfolgen kann.

Für die Simulation der DEP-Trennstufe wurden Module für elektrischen Strom, Flüssigkeitsfluss und Partikelverfolgung verwendet. Das Modell besteht aus einer stationären stationären Zustands-, Frequenzbereichs- und transienten Studie. Geschwindigkeit, Druck und elektrische AC-Potenzialverteilungsfelder wurden mithilfe einer stationären Studie berechnet, während die transiente Studie zur Erzeugung von Partikelflugbahnen verwendet wurde, die von der DEP-Kraft beeinflusst wurden. Für die Physik der elektrischen Ströme wurde die Randbedingung der elektrischen Isolierung für die Wände des Mikrokanals gewählt. Das Definieren des elektrischen Potentials an den Elektroden würde die Positionen der Elektroden innerhalb der Wände außer Kraft setzen. Es wurden quadratische Elektroden mit einer Seitenlänge von 80 μm verwendet, die für die Herstellung geeignet sind. Zur Erzeugung eines elektrischen Feldes wurden Elektroden mit gleicher Spannung und wechselndem Vorzeichen verwendet. An die Elektroden wurde ein elektrisches Potential im Bereich von 3,5–5 V angelegt. Zur Berechnung des elektrischen Feldes wurde das feine Netz gewählt, während für die Lösung des Fluidströmungsfeldes ein grobes Netz erzeugt wurde. Um die Lösung zu verfeinern, wurden in der Nähe scharfer Ecken verschiedene Netze verwendet. Für die stationäre Untersuchung des Flüssigkeitsflusses wurde ein algebraischer Mehrgitterlöser (AMG) oder Vorkonditionierer als linearer Löser verwendet, das elektrische Feld wurde mit dem iterativen Löser BiCGStab berechnet und der iterative GMRES-Löser mit der Jacobi-Methode wurde für die Zellverfolgung verwendet. Im Fall der Partikelverfolgung wurde die Randbedingung für die Kanalwände der DEP-Stufe auf „Abprallen“ und die Auslassbedingung auf „Kleben“ eingestellt, was bedeutet, dass die Zellen im Falle einer Kollision zurückprallen bzw. an den Auslässen kleben würden. Die vom Auslass der ersten Stufe abgetrennten Zellen (CTCs und WBCs) gelangen in den Bereich der zweiten Stufe. Da der größte Teil des Volumens zusammen mit den Erythrozyten und Blutplättchen im Trägheitsstadium zurückgewiesen wird, wurde mehr Puffer (0,1xPBS) für den Fokussierungsfluss benötigt. Die Flüssigkeitssuspension war in diesem Stadium insgesamt eine Newtonsche Strömung und hatte daher eine niedrige elektrische Leitfähigkeit von ~ 0,055 S/m. Eine solche Konfiguration erzeugt sowohl eine pDEP- als auch eine nDEP-Kraft, um Zellen in Richtung der Elektroden bzw. von ihnen weg zu bewegen. Auf dem Weg der Leukozyten und CTC war ersteres in der Nähe der Elektroden zu erkennen. Daher kann gefolgert werden, dass auf Leukozyten eine pDEP-Kraft ausgeübt wird, während auf CTCs eine nDEP-Kraft ausgeübt wird.

In dieser Arbeit wurde zunächst ein inertialer Mikrofluidikkanal basierend auf der Studie von Shamloo et al. numerisch simuliert. Das Gerätedesign wurde entsprechend der gewünschten Probe, dh Vollblut, geändert, nachdem die Grundgeometrie im Lichte der Untersuchungsergebnisse von Shamloo et al.79 überprüft wurde. Die untersuchten Partikel waren 12,2, 6,58, 9,26, 9,42, 4 und 2 µm groß im Durchmesser repräsentieren CTCs, Leukozyten (vier Haupttypen), Erythrozyten bzw. Blutplättchen. Um die optimalen Designparameter zu finden, wurde die Beziehung zwischen Kanalseitenverhältnis, Durchflussrate und Abscheideeffizienz untersucht. Anschließend wurde die DEP-Stufe separat entworfen und dann seriell in den Trägheitsmikrokanal integriert, um die CTC-Isolierung aus der Vollblutprobe zu erleichtern und zu verbessern.

Das vorgeschlagene Modell nutzt die Trennungsgeometrien „Curved“ und „Contraction-Expansion Array“ (CEA) aus. Zusätzliche Trägheitskräfte werden eingeführt, wenn der Mikrokanal gekrümmt ist oder sich sein Seitenverhältnis ändert (z. B. krummlinige Geometrien bzw. CEAs). Solche geometrischen Änderungen induzieren eine transversale sekundäre Dean-Strömung im Mikrokanal. Die kombinierte Architektur wurde entwickelt, um die Dean-Strömungswirbel im Vergleich zu geraden CEA-Geometrien in einer kürzeren markanten Länge auf das Trennniveau zu verstärken. Ursprünglich wurden nur vier Zelllinien berücksichtigt, nämlich RBC, Plt, WBC und hGBM. Zwei innerhalb des Kanals erzeugte Dean-Wirbel (Abb. 7) verstärken sich gegenseitig, was zu einer maximalen Geschwindigkeitsgröße führt, um eine maximale Trenneffizienz und Reinheit für CTCs zu erreichen.

Sekundäre Strömungswirbel oder Dean-Strömungswirbel erscheinen im gekrümmten Kanal und ändern ihre Stärke entlang der Breite, um die maximale Geschwindigkeitsgröße zu erreichen. Die Pfeile zeigen die Dean-Widerstandskraft. Das Gleichgewicht zwischen Widerstands- und Trägheitsauftriebskräften bestimmt abhängig von der Partikelgröße die endgültige Richtung des Partikels durch den Kanal. Die kleineren Partikel folgen der Strömungslinie und bewegen sich in Richtung des oberen Auslasses, während sich die großen Partikel in Richtung des unteren Auslasses bewegen.

Der Großteil der verfügbaren Literatur berücksichtigt den mittleren Durchmesser von Leukozyten und vernachlässigt die tatsächlichen Varianten von Leukozyten oder Leukozyten. Dies führt zu einem inhärenten Fehler oder einer Einschränkung in den Ergebnissen. Unter Berücksichtigung praktischer Bedingungen haben wir unserem Modell Subtypen von Leukozyten hinzugefügt, nämlich Monozyten, T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und Granulozyten. Mechanische und dielektrische Eigenschaften wurden genutzt, um Leukozyten (Granulozyten und Monozyten) von CTCs zu trennen. Unsere Analyse zeigt, dass sich nur CTCs auf der rechten Seite des Kanals konzentrieren (Abb. 8), während sich andere Zellen auf der linken Seite ansammelten. Wie bereits erwähnt, werden große Zellen, dh CTCs, durch die Trägheitsauftriebskraft beeinflusst, die sie in einer nahezu konstanten Position in Bezug auf die Kanalwand hält. Im Gegenteil, der im gekrümmten Bereich erzeugte Dean-Fluss führt dazu, dass sich die restlichen kleineren Zellen zum Auslass Nr. 2 von Stufe 1 konzentrieren. Abbildung 8 zeigt die Flugbahnen der Zellen vom Partikelverfolgungsmodul, interessanterweise T- und B-Lymphozyten ( 6,58 μm) wurden zusammen mit Erythrozyten und Plts abgetrennt, während Granulozyten und Monozyten in ihrer Größe mit CTCs vergleichbar sind und zusammen mit CTCs an das DEP-Stadium abgegeben wurden. Es wurde beobachtet, dass Leukozyten mit einer Größe nahe Plts und RBC (2–6 µm) zusammen mit ihnen ausgeschieden werden. Während bestimmte Arten von Leukozyten mit Durchmessern nahe dem CTC (9–12,2 µm) miteinander auskommen, gelangen sie in die zweite Stufe des Mikrofluidikgeräts. Diese Ergebnisse haben unsere Hypothese bestätigt, dass eine kombinierte Geometrie mit gekrümmter und CEA die erforderlichen Ergebnisse bei kleineren Längen erzielen könnte.

Ergebnisse der Partikelverfolgung einer Vollblutprobe unter Berücksichtigung der Subtypen von Leukozyten. Die Farblegende zeigt die Größe der injizierten Partikel. Im Expansionsbereich erfolgt die Trennung kleiner Partikel, d. h. Erythrozyten und Blutplättchen, von den größeren Partikeln, d. h. CTCs und WBCs, und diese bewegen sich weiter in Richtung ihrer jeweiligen Auslässe. Es wurde jedoch beobachtet, dass bestimmte Untertypen von Leukozyten zusammen mit Erythrozyten und Plts ihren Weg zum Abfallauslass fanden, wo die Erythrozyten und Plts zunächst aussortiert wurden.

Um die Leistung der vorgeschlagenen Inertialstufe zu bewerten, haben wir die Trenneffizienz und Reinheit der Zellsuspension bei verschiedenen Aspektverhältnissen im Bereich von 0,8–2 berechnet. Im Allgemeinen wurde beobachtet, dass die Abscheideleistung schlecht ist, wenn das Seitenverhältnis < 1 ist. Bei einem Seitenverhältnis von 1 steigt die Abscheideleistung der ersten Stufe auf 100 % (Abb. 9). Zwischen dem Seitenverhältnis 1 und 2 wanderten bestimmte Arten von Leukozyten, deren Größe mit der von Erythrozyten vergleichbar ist, ebenfalls zum Auslass Nr. 1. Insgesamt wird für ein Seitenverhältnis ≥ 1 eine Erythrozyten- und Thrombozyten-Trenneffizienz von 100 % erreicht. Der Schwellenwert des Verhältnisses ap/Dh liegt bei ~ 0,1 für maximale Trenneffizienz, wie von81 berichtet.

Trenneffizienz im Verhältnis zum Seitenverhältnis von Erythrozyten und Blutplättchen. Der niedrige AR der vorgeschlagenen kombinierten Geometrie erwies sich als geeignet für maximale Trenneffizienz.

Die Geschwindigkeitsfeldverteilung des zweistufigen Mikrofluidikgeräts ist in Abb. 10 dargestellt. Das Oberflächendiagramm zeigt eine Abnahme der Geschwindigkeit, während Flüssigkeit in den Expansionsbereich und dann in die symmetrischen gegabelten stromabwärtigen Kanäle übertragen wurde. Dies geschieht aufgrund des hydraulischen Widerstands, der direkt mit dem dynamischen Druck der Flüssigkeit zusammenhängt. Die Geschwindigkeitsgröße ändert sich aufgrund der Änderung der Stärke des sekundären Strömungswirbels und aufgrund geometrischer Änderungen durch den Kanal. Die Geschwindigkeit der Partikel wurde durch eine Vergrößerung der Kanalbreite von 50 auf 175 μm verringert. Diese Geschwindigkeitsreduzierung verlangsamte anschließend die Zellen und ermöglichte es ihnen, der DEP-Kraft ausgesetzt zu werden. Dadurch wurde auch das elektrische Feld innerhalb des Kanals verringert, was zu einer Entnahme lebensfähiger Zellen führte und die Zellisolierung an den Auslässen erleichterte.

Geschwindigkeitsfeldverteilung des vorgeschlagenen Hybridgeräts. Das Oberflächendiagramm der Geschwindigkeit zeigt das Geschwindigkeitsfeld innerhalb des vorgeschlagenen Geräts im Farbspektrum an. Wenn der Fokussierungspuffer injiziert wird, ist die Geschwindigkeit um seinen Einlass herum hoch (dargestellt durch den roten Bereich). Die Zellsuspension wurde mit niedriger Geschwindigkeit injiziert, wodurch die Geschwindigkeit des Flüssigkeitsstroms im gekrümmten, kontrahierten Bereich (dargestellt durch den grünen Bereich) verringert wurde. Wenn die Flüssigkeit in den erweiterten Bereich eintritt, verringert sie die Geschwindigkeit weiter (dargestellt durch den blauen Bereich). Am Ende der Trägheitsstufe wird der einzelne Kanal gegabelt, wodurch der Volumenstrom geteilt und reduziert wird. Die Kanalgröße der DEP-Stufe wurde weiter erhöht. Dieser Ausgleich des hydraulischen Widerstands fördert die gleichmäßige Strömungsverteilung über die DEP-Stufe, wo mit der Flüssigkeitsströmungssimulation ein gleichmäßig blaues Spektrum erhalten wird.

Abbildung 1 zeigt das vorgeschlagene Design der DEP-Stufe, um eine kontinuierliche Zelltrennung sicherzustellen, wobei Flüssigkeitsfluss, dynamischer Druck und Geschwindigkeit, die innerhalb des entworfenen Kanals erzeugt werden, analysiert wurden. Für die effektive Kontinuität der Strömung wurde der dynamische Flüssigkeitsdruck des Mikrofluidikkanals untersucht. Die DEP-Stufe wird durch Parameter wie angelegte Spannung, Frequenz und Anzahl der Elektroden bestimmt. Der CM-Faktor von Leukozyten und hGBM wird in Abhängigkeit von der angewendeten Frequenz in Abb. 2 berechnet. Die Kreuzungsfrequenzen von Leukozyten, dh Monozyten, Granulozyten, T-Lymphozyten und B-Lymphozyten, liegen zwischen 220 und 330 kHz. Allerdings liegt die Übergangsfrequenz von hGBM bei etwa 511 kHz. Um CTCs aus Leukozyten zu isolieren, kann daher eine Frequenz zwischen 331 und 500 kHz verwendet werden, um pDEP bei Leukozyten und nDEP bei hGBM zu induzieren.

Wir haben unter pDEP untersucht, wie signifikant der Verhaltensunterschied zwischen allen Leukozytenvarianten ist, indem wir die angelegte Frequenz zunächst auf 350 kHz festgelegt haben. Die Spannung konnte in einem weiten Bereich variiert werden. Da Zellen anfällig für ein hohes elektrisches Feld sind, sind niedrige Arbeitsspannungen wünschenswerter. Daher untersuchen wir den Zelltrennungsprozess mit Frequenzen zwischen 350 und 400 kHz und Spannungen zwischen 2 und 5 V. Es wurde beobachtet, dass zur Trennung von Leukozyten von CTCs für eine bestimmte Kombination aus Spannung und Frequenz eine bestimmte Anzahl von Elektroden erforderlich ist . Die Verwendung von neun Elektroden gewährleistete eine ausreichende Trennung bei einer Frequenz von 370 kHz. Abb. 11 zeigt die endgültigen Flugbahnen der Partikel, die eine 99,5-prozentige Trennung von CTCs von Leukozyten oder Leukozyten zeigen. Video 1. Über eine sehr ähnliche Art von Befunden zu Brustkrebs wurde berichtet Mond und Kollegen; In ähnlicher Richtung wurde auch früher über Darmkrebs und Lukämie berichtet, was unsere aktuellen Ergebnisse untermauert39,82,83,84.

Ergebnis der Partikelverfolgung. Erfolgreiche Trennung von CTC von Leukozyten im DEP-Stadium. Zellsuspension mit zufälliger Verteilung von Leukozyten und CTCs aus der Inertialstufe gelangt in den Einlass der DEP-Stufe. Farblinien sind Zellbahnen, Blau und seine Schattierungen stellen Leukozyten dar, während CTCs durch rote Farbe dargestellt werden.

Diese Studie demonstriert den Entwurf und die Simulation eines hochspezifischen, kontinuierlichen, markierungsfreien zweistufigen mikrofluidischen Sortiergeräts, das auf Trägheitsfokussierung und DEP basiert, um CTCs (hGBM) aus Vollblut zu isolieren. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, die Einschränkungen der DEP-Methode durch Hinzufügen einer größenbasierten Trennstufe vor der Anreicherung zu beseitigen. In der Voranreicherungsphase machen kleine Zellen (typischerweise Erythrozyten und Plts) den größten Teil des Blutvolumens aus, dh 45 % werden abgetrennt. Diese Zellen sind für die Blutleitfähigkeit und die nicht-Newtonsche Natur verantwortlich. Ihre Trennung in der Anfangsphase erhöht die Reinheit und Effizienz der Isolierung von CTCs. Die verbleibenden Leukozyten und CTCs mit vergleichbaren Größen (9,26–12,2 µm) wurden zur DEP-Stufe transportiert, wo die Trennung basierend auf den elektrischen Eigenschaften der oben genannten Zellen durchgeführt wird. Die resultierenden CTCs sind lebensfähig und können weiter zur Diagnose und zur Entwicklung einer patientenspezifischen Therapie genutzt werden, wodurch die vorgeschlagene Methodik nützlicher wird. Die Ergebnisse zeigen einen Reinheitsgrad von 99,5 % bei einem hohen Durchsatz von 12,2 ml/h. Um die Trenneffizienz zu verbessern, wurden mehrere Computersimulationen durchgeführt, um unser vorgeschlagenes Design und unsere Integration zu überprüfen. Diese integrierte Gerätesimulation demonstrierte die effiziente Sortierung der Zellen mithilfe unseres zweistufigen Inertial-DEP-Geräts. Im ersten Schritt wurden kleine Erythrozyten und Plts mithilfe der Trägheitsfokussierungstechnik aus den Blutproben getrennt. Große Zellen wie CTCs und Leukozyten wurden mithilfe der DEP-Kraft voneinander getrennt. Die meisten Forscher verwendeten zum Testen versetzte oder binäre Proben, was eine inhärente Einschränkung für die klinische Praxis mit sich bringt. Wir haben eine Vollblutprobe zusammen mit PBS mit einem zulässigen Verdünnungsverhältnis von 1:10 verwendet. Wir haben in unserer Untersuchung hGBM als CTC verwendet, für das nach unserem besten Wissen keine DEP-Abtrennung gemeldet wurde. Das vorgeschlagene Gerät kann jedoch zur Isolierung anderer Arten von Tumorzellen (vorausgesetzt, die Größe ist mit Leukozyten vergleichbar) verwendet werden, indem die Designparameter der DEP-Stufe, dh die angelegte Frequenz und Spannung, geändert werden.

Das vorgeschlagene Gerätedesign hatte das Konzept, das Problem des Zellverlusts, der Zellfragmentierung, der Zytotoxizität und der Zellverformung zu überwinden, die bei den meisten Arten von Zelltrennungsmethoden während der Probenvorbereitung auftraten. Die Studie verwendete die Trägheitsflusstrennungsmethode anstelle der Zentrifugation. Normalerweise wird die Zentrifugation als Voraussetzung für die Vorbereitung klinischer oder Labortestproben durchgeführt, was die oben genannten Probleme verursacht. Da Leukozyten und die meisten CTCs eine ähnliche Größe haben, ist die Trägheitsmethode aufgrund der WBC- oder Leukozytenkontamination für die CTC-Sortierung nicht sehr beliebt. Die vorliegende Studie verwendete eine markierungsfreie DEP-Methode, die verschiedene Zelltypen entsprechend ihrer Bewegung als Reaktion auf das DEP-Feld sortiert. Dies ist auf die Unterschiede in der Kreuzungsfrequenz der Zellen aufgrund ihrer einzigartigen dielektrischen Eigenschaften zurückzuführen. Die Studie verwendet eine zweistufige Methode, wodurch die Zellpopulation reduziert wird. Außerdem verringern niedrige Spannung und Frequenz die Möglichkeit einer Jouleschen Erwärmung und Zelllyse. Obwohl diese Methode eine hohe Isolationseffizienz aufweist, weist sie den Nachteil eines geringen Verarbeitungsvolumens, der Möglichkeit einer Zellverstopfung aufgrund von Überlastung und Joule-Erwärmung aufgrund angelegter Spannungen auf. Das insgesamt begrenzte Verarbeitungsvolumen ist auf die serielle Integration zurückzuführen. Unser Gerätedesign bietet eine Gesamtisolationseffizienz oder Zellrückgewinnung von bis zu 99,5 %. Insgesamt hat unsere vorliegende Simulationsstudie das Potenzial für ein hocheffizientes Gerät. Allerdings gibt es genetisch bedingte Variationen in der Probe, Variationen aufgrund der Rasse und des Vorhandenseins anderer Krankheiten sowie medizinische Therapien, die die Konsistenz, Viskosität, Zelltoxizität usw. der Probe beeinflussen können.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82170481), der Anhui Natural Science Foundation (2008085J39 und 2108085MH314), der Natural Science Foundation of Anhui Educational Committee (KJ2020A0728) und dem State Key Laboratory for Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources (Guangxi) unterstützt Normal University) (CMEMR2021-B03), Ausgezeichnetes erstklassiges Talenttrainingsprogramm der Anhui-Universitäten (gxbjZD2022073), Schlüsseldisziplinen der Pharmazie (2019xjzdxk2) und Suzhou Engineering Research Center of Natural Medicine and Functional Food (SZ2017ZX06).

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Hong Duan & Kefeng Zhai

Schlüssellabor für Chemie und Molekulartechnik medizinischer Ressourcen (Guangxi Normal University), Guilin, 541004, Volksrepublik China

Kefeng Zhai

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BMS konzipierte die Idee, führte die Studie durch und schrieb das Manuskript, und KGJ konzipierte die Idee, organisierte die Studien und schrieb den Haupttext des Manuskripts, und DH bereitete die Abbildungen 4, 5, 6, 7, 8 und 9 für ein klareres Verständnis vor. RM betreute die Studien und überprüfte das Manuskript, und ZKF überprüfte das Manuskript und ist korrespondierender Autor.

Korrespondenz mit Mohsin Rizwan, Hong Duan oder Kefeng Zhai.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Bakhshi, MS, Rizwan, M., Khan, GJ et al. Design eines neuartigen integrierten Mikrofluidikchips zur kontinuierlichen Trennung zirkulierender Tumorzellen von peripheren Blutzellen. Sci Rep 12, 17016 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-20886-1

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Eingegangen: 09. Mai 2022

Angenommen: 20. September 2022

Veröffentlicht: 11. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-20886-1

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